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鸟氨酸转氨酶(OAT)测试盒(比色法)
AS6321113
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鸟氨酸转氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)试剂盒说明书

                                                    微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同时产生NAD,通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配制   

提取液:液体110mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体30 mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加8mL试剂一充分溶解;用不完的试剂4℃保存。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加8mL试剂一充分溶解;用不完的试剂4℃保存。

试剂四:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加4mL试剂一充分溶解;现配现用。

酶液提取

  1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心10min,取上清置冰上待测。
  2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,10000g离心10min,取上清置冰上待测。
  3. 液体:直接检测。

测定操作

  1. 酶标仪预热30min,调节波长至340nm。
  2. 将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。(注意:粉剂试剂需要自行配制
  3. 取96孔板,依次加入60μL试剂二,60μL试剂三,60μL试剂四,20μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2,△A=A1-A2。
  4. 计算公式

用96孔板测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

 

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T

=321.54×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

 

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