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酸性蛋白酶测试盒(比色法)
AS6321172
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酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)试剂盒说明书

                                           微量法 100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理:

酸性条件下,ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;钨蓝在680nm有特征吸收峰,通过测定其吸光度增加,来计算ACP活性。

自备仪器和样品:

水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、0.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配置:

液体一:2mL×1支,4℃保存。

液体二:1mL×1支,4℃保存。

试剂一的配制:临用前液体一:液体二:蒸馏水=90(μL:20(μL:21(mL的比例配制,现配现用,如出现白色絮状沉淀则不能用。 

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热15-30分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入20mL蒸馏水溶解。

试剂五:液体4mL×1瓶,4℃保存。

标准品:液体1mL×1支,0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

  1. 试剂一的配制:见试剂的组成和配制。

2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。

  1. 血清或培养液:直接测定。
  2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。

3. 对照管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂三,混匀后8000g,4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,680nm测定光吸收,记为A对照管。

4. 测定管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂二,混匀后8000g,4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5. 空白管:取0.5 mL EP管,加入40μL蒸馏水,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A空白管。

6. 标准管:取0.5 mL EP管,加入40μL标准品,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A标准管。

ACP活性计算公式:

1. 按照样本蛋白浓度计算

ACP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min /mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

ACP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min /g鲜重)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3. 按照液体体积计算

ACP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

按照细胞数量计算

ACP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min /104 cell)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量

C标准品:0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液;V反总:酶促反应总体积,0.1mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.02 mL;V2:提取液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min;W:样品质量(g)。

注意事项:

1.试剂一按操作指示配制,用多少配多少,出现白色絮状沉淀则不能用。

2.临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。

 

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