普通PCR又称终点PCR,是最传统与基础的PCR方法,这种方法通过在产物正常扩增结束后,进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳等方式对产物染色、拍照,通过得到的条带亮度对PCR产物的量、片段长度进行分析。但是我们要注意很重要的一点,普通PCR不能反映反应体系的起始状态,即样品差异、扩增效率差异等多种情况都可能会导致最终的扩增效果,所以这种方法比较适用于疾病诊断与某些定性研究分析。
荧光定量PCR即qPCR、Real-time PCR,都是实时定量PCR。其原理就是在PCR反应体系中加入特定的探针,其中含有荧光基团,荧光定量PCR仪在每一个扩增循环都会收集积累的荧光信号,从而达到对反应体系的全程监控与定量分析,所以qPCR既可以反映反应体系的起始状态,也可以反映最终扩增效果,相比于普通PCR更精确,更简单。
普通PCR与荧光定量PCR二者的实验结果相同,都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。但是二者的不同主要集中 在以下几个方面:
1、二者原理不同
荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。
2、二者系统组成不同
荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。
3、二者反应要求不同
荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp,普通PCR可以扩增长点的片段。
4、二者应用不同
荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。
5、二者测量成本不同
定量PCR仪价格较为昂贵,普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。