过氧化氢含量（H2O2）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
H2O2是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H2O2不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H2O2也是许多氧化应急反应中的关键调节因子，。
测定原理：
H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100mL、浓盐酸5mL、研钵和冰。
试剂的组成和配制：
试剂一：丙酮100mL×1瓶，4℃保存；（自备）
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4℃保存；(溶解时间较长，约30min，可40℃-60℃加热，务必提前准备)
试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；
H2O2提取：
1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；用试剂一定容至1mL；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织样品的制备：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆；转移至EP管中，用试剂一定容至1mL，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
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试剂名称（μL） |
测定 |
对照 |
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样本 |
250 |
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试剂一 |
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250 |
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试剂二 |
25 |
25 |
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试剂三 |
50 |
50 |
4000g，25℃离心10min，弃上清，留沉淀
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试剂四 |
250 |
250 |
加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值A。对照管只要做一次即可。计算ΔA＝A测定-A对照。
注意事项：
1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。
2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。
H2O2含量计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.7488x + 0.0006 (x为标准品浓度，μmol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）中H2O2含量的计算：
H2O2含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)
3、细菌、细胞或动物组织中H2O2含量计算
（1）按照蛋白浓度计算
H2O2含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样本质量计算
H2O2含量(μmol/g鲜重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
H2O2含量(μmol/104)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.3744x + 0.0006 (x为标准品浓度，μmol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）中H2O2含量的计算：
H2O2含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)
3、细菌、细胞或组织中H2O2含量计算
（1）按照蛋白浓度计算
H2O2含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样本质量计算
H2O2含量(μmol/g鲜重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
H2O2含量(μmol/104)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)
V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
注意：标曲线性范围为0.1μmol/mL-2μmol/mL，吸光度ΔA线性范围为0.03-1，若ΔA超过1则需要稀释，计算公式乘以相应稀释倍数。
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资料/datasheet
