丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
测定原理
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液：100mL×1瓶，4℃保存;
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；；
试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；
试剂三：液体10μL×2支，4℃保存；
样本的前处理
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
（1）试剂二的配制：临用前取试剂二一瓶，加入9mL试剂一和1.06mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用。
（2）试剂三的配制：临用前取试剂三一支，加入0.6mL蒸馏水充分溶解待用；现配现用。
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
PK活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）中PK活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PK活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.216×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）中PK活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=3216×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PK活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.432×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
扫描二维码
扫描二维码
资料/datasheet
