葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate， 6P G)含量测定试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又称6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH的主要途径。此外，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。
测定原理：
6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，在450 nm下测定吸光值。
需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体60 mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体12mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1.5mL×1管， 4℃避光保存。
6PG提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，8000g，25℃离心10min，取上清待测。
3、血清（浆）等液体样品：直接测定。
测定步骤：
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。
2、试剂二的配制：临用前加入3mL水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；
3、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液
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试剂名称（μL） |
测定工作液 |
对照工作液 |
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试剂一 |
100 |
100 |
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试剂二 |
50 |
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水 |
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50 |
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试剂三 |
10 |
10 |
按下表在96孔板中加入如下试剂
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试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
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样本 |
50 |
50 |
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测定工作液 |
150 |
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对照工作液 |
|
150 |
37℃避光孵育30min，450nm下测定吸光值A测定与A对照，△A=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
6PG含量计算：
1、标准条件下测定回归方程为y = 3.8589x - 0.0016，R2 = 0.997； x为6PG含量（μmol/mL），y为吸光值。
2、按照血清（浆）体积计算
6PG含量（nmol/mL）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000
=259.1×(△A+0.0016)
3、按照蛋白浓度计算
6PG含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
6PG含量（nmol/g鲜重）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
6PG含量（nmol/104 cell）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000
=0.518×(△A+0.0016)
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；1000，μmol到nmol的换算系数。
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资料/datasheet
