测任何目标蛋白的抗体不止一种,同一家抗体公司可能有好几种,甚至几十种。在不同的抗体公司,则更多。那么在眼花缭乱的抗体阵中,如何选择自己实验需要的抗体呢?选择适合实验的抗体需要综合考虑多个因素,包括实验类型、样本种属、抗体的特异性、宿主物种来源以及是否需要荧光标记等。
以下是选择抗体时应遵循的基本步骤和注意事项:
1. 确定实验类型:不同的实验技术如Western Blot (WB)、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)、流式细胞术(FC)等对抗体有不同的要求。例如,WB实验最好选择特异性高、能识别线性表位的抗体,而IF和IHC可能需要能识别天然结构的抗体。
2. 确认目标蛋白:了解你要检测的蛋白的名称、亚型、修饰状态(如磷酸化、乙酰化等),并寻找能特异性识别该蛋白的抗体。
3. 选择合适的种属:抗体的反应种属应与你的实验样本匹配。如果样本是人源的,应选择反应种属包含人的抗体。不同种属的抗体可能会对同源蛋白有交叉反应,但通常会注明可反应的种属范围。
4. 抗体类型:单克隆抗体(mAb)特异性高,但亲和力可能不如多克隆抗体(pAb),后者通常具有更好的亲和力和敏感度。根据实验需求选择合适的抗体类型。
5. 宿主物种来源:在选择一抗时,注意宿主物种来源,因为这会影响二抗的选择。例如,如果一抗是小鼠来源的,二抗应选择抗小鼠的,以避免内源性免疫球蛋白的干扰。
6. 荧光和化学发光标记:对于需要荧光检测的实验(如IF、FC),选择带有合适荧光标记的抗体。确保所选荧光染料与你的检测仪器兼容,并注意荧光之间的重叠,以减少补偿问题。
7. 验证信息:选择经过实验验证的抗体,最好选择有大量文献引用的抗体,这通常意味着该抗体的性能得到了广泛认可。
8. 同型对照抗体:在流式细胞术等实验中,使用同型对照抗体可以排除非特异性结合的背景信号。
9. 抗体稀释和孵育条件:根据说明书调整抗体的稀释比例和孵育时间,以优化信号和减少背景。
10. 供应商和质量:选择信誉良好的供应商,确保抗体的质量和稳定性。有时,免费的抗体样品测试可以帮助你确认抗体是否适合你的实验。
通过上述步骤,你可以选择到最适合你实验需求的抗体,从而提高实验的成功率和结果的可靠性。