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发布日期:2025/5/13 11:44:00

 

实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是通过PCR仪,模拟DNA半保留复制,从而体外快速扩增DNA的方式。

 

1. 高温变性:所谓变性是95℃左右时DNA双链打开的过程,使之能够与引物结合,为下面的反应做准备。但是注意考点:这里的DNA不只是我们加进去的模板DNA,还包括扩增出来的DNA,体系里但凡是双链,高温都能给他打开了。

2. 低温退火:退火是个很亲切的词,这是我们做无机非金属里面的概念,不知道是哪位巨巨给引入了生物学。所谓退火就是适宜条件下冷却的过程,上面说到DNA高温变性,变性后的单链与引物通过碱基互补配对,再次形成局部双链。更准确的来讲应该叫复性,恢复双链的过程。

3. 中温延伸:模板-引物接头之后,对你没看错,人家就叫接头,浓浓的社会气息。延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为原料,以靶向序列为模板,碱基互补配对为原则,再次合成完整的双链DNA的过程。我们可以看到这里复制之后实际上有一条链是新合成的,另一条则是原先就存在的,因此说这叫半保留复制。

实验步骤:

一、 样品RNA的抽提

1. 取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

2. 两相分离 每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,1530℃孵育23分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%

3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后1530℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4. RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。

5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

 

二、 RNA质量检测

1. 紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

1)浓度测定

A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中,取5 μl1:100稀释至495 μlTE中,测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 0.84 μg/μl

5 ul用来测量以后,剩余样品RNA35 μl,剩余RNA总量为:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

2)纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.82.1

 

2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定

1)制胶

1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml10× MOPS电泳缓冲液和18 ml37% 甲醛溶液(12.3 M)

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分

0.4 M MOPSpH 7.0

0.1 M 乙酸钠

0.01 M EDTA

灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

2)准备RNA样品

3 μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

3)电泳

上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm

4)紫外透射光下观察并拍照

28S18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNAtRNA5S核糖体RNA)组成。在18S28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

 

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