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NAD激酶(NADK)测试盒(比色法)
AS63212
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NAD激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书

                               微量法100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。

 

测定原理:

NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+;NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH;在340 nm下测定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

 

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

提取液:液体100 mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体10 mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体25 mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20 ℃保存;

试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存;

 

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。
 

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min以上。

3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入5mL试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

   工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入18mL试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

4、加样表

试剂名称(μL)

测定孔

对照管

样本

20

20

工作液Ⅰ

80

 

试剂一

 

80

充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min,立即煮沸

2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,25℃离心10min,取上清

上清液

40

40

工作液Ⅱ

160

160

加完试剂混匀,室温静置15min,340nm下测定吸光值,ΔA=A测定-A对照。

NADK活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)NADK活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=53.59×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NADK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=53.59×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.107×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)NADK活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=107.18×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NADK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=107.18×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.214×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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