酰基转移酶（alcohol acyl transferase，AAT）活性测定试剂盒说明书
微量法 100管/96样
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
测定原理：
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，释放的CoA还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率可计算AAT活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。
试剂三：粉剂×1支，4℃避光保存。
粗酶液提取：
AAT测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入18mL试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇1mL充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。
4、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入10μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。
5、 测定管：在Ep管或96孔板中加入10μL样本和180μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入10μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。
AAT活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（
×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷（
×d）×V反总÷(W×V样÷V样总) ÷T
= 98.04×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（
×d）×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T
= 98.04×△A÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（
×d）×V反总÷V样÷T
= 98.04×△A
：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径：1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，15 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（
×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T
=196.08×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷（
×d）×V反总÷(W×V样÷V样总) ÷T
= 196.08×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（
×d）×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T
=196.08×△A÷ 细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（
×d）×V反总÷V样÷T
= 196.08×△A
：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：96孔板光径：0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，15min。
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资料/datasheet
