BCA法蛋白含量测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定
测定意义:
样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外,可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。
测定原理:
碱性条件下,蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽键,能将Cu2+还原成Cu+;2分子的BCA与Cu+结合,生成紫色络合物,在540-595nm有吸收峰,562nm处吸收峰最强。
自备仪器和用品:
台式离心机、恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂A:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂B:液体0.5mL×1支,4℃保存。
标准品:液体2mL×1支,4℃保存。
工作液配制:临用前请根据拟用工作液体积(样本数×0.2mL),将试剂A和B按照50:1的比例混合,盖紧后充分混匀。
样品中可溶性蛋白质提取:
- 液体样品:澄清液体样品可以直接测定。
- 组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液(自备,根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水)
冰浴匀浆,10000rpm,4℃离心10min,取上清,即待测液。
3. 细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000rpm,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
测定操作:
1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到562 nm,蒸馏水调零。
2. 工作液置于60℃水浴预热30 min。
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空白管
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标准管
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测定管
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蒸馏水(μL)
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4
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标准品(μL)
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4
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待测液(μL)
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4
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工作液(μL)
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200
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200
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200
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混匀后置于60℃保温30min,于微量玻璃比色皿/96孔板,于562nm处测定吸光值A,分别记为A空白管、A标准管、A测定管。
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注意:空白管和标准管只需要做一次。
计算公式:
Cpr (mg/mL)= C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
=0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
Cpr (mg/g 鲜重)= C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ W
=0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ W
W: 样本质量,g
注意事项:
BCA法蛋白含量测定试剂盒,适用于测定蛋白浓度在20-5000μg/ml样品。测定前取1-2个样做预实验,若A测定管-A空白管﹥1.5,需将样本用提取液稀释后再测定,以确保测定的准确性。