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维生素B1测试盒(比色法)
AS6321382
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维生素B1(Vitamin B1,VB1)试剂盒说明书

微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素B1(Vitamin B1)是构成脱羧辅酶的主要成分,参与细胞代谢中的三羧酸循环,是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素,在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB1在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾,亚铁氰化钾与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝,在704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制 

提取液:液体70mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体1mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体2mL×1支,4℃保存。

试剂三:液体2mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂四:液体5mL×1瓶,4℃保存。

试剂五:液体3mL×1瓶,4℃避光保存。

样本处理

  1. 组织:将样品磨碎,按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸馏水0.4mL,混匀后于25℃,16000rpm离心10min,取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min)。
  2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入0.6mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);加蒸馏水0.4mL,混匀后于25℃,16000rpm离心10min,取上清测定。
  3. 血清:直接测定。                   

测定操作

 

空白管

测定管

样品(μL)

 

20

试剂一(μL)

20

 

试剂二(μL)

16

16

试剂三(μL)

20

20

充分混匀,80℃反应10min

提取液(μL)

16

16

试剂四(μL)

44

44

试剂五(μL)

24

24

H2O(μL)

60

60

充分混匀,静置20min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸馏水调零,测定704nm处吸光值,记为A空白管和A测定管,△A=A测定管-A空白管。

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y = 0.017x+0.0031,R2 = 0.9991;x为标准品浓度:μg/mL;y为△A(A测定管-A空白管)

1. 按照蛋白含量计算

VB1含量(μg/mg prot)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷Cpr

                    = 58.8×(△A-0.0031)÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(W÷V样总)

                = 58.8×(△A-0.0031)÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1含量(μg/104 cell)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(细胞数量÷V样总)

                     = 58.8×(△A-0.0031)÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.017

                  = 58.8×(△A-0.0031)

V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y = 0.0085x +0.0031,R2 = 0.9991;x为标准品浓度:μg/mL;y为△A(A测定管-A空白管)

1. 按照蛋白含量计算

VB1含量(μg/mg prot)=(△A -0.0031)÷ 0.0085÷Cpr

                    = 117.65×(△A-0.0031)÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031))÷ 0.0085÷(W÷V样总)

                = 117.65×(△A-0.0031)÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1含量(μg/104 cell)=(△A-0.0031)÷ 0.0085÷(细胞数量÷V样总)

                     = 117.65×(△A-0.0031)÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.0085

                  = 117.65×(△A-0.0031)

V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g

 

注意事项

  1. 若测定结果中吸光值超过2,请将样本稀释后进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
  2. 蛋白浓度较高的样品,比如动物组织,若显色完成后有沉淀产生,将样本稀释后再重新测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
  3. 显色完成后立即进行测定。
  4. 标准曲线线性范围为0.1-10μg/mL。
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