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红霉素N脱甲基酶(ERND)测试盒(比色法)

试剂别名:
CAS NO.:
分 子 式:
分 子 量:

红霉素-N-脱甲基酶(ERND)活性测定试剂盒说明书

                                                      微量法 100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的酶系,在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物的代谢,具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型,与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用,也可使某些药物经CYP2B代谢活化。

测定原理:

ERND催化红霉素释放甲醛,通过Nash比色测定甲醛含量,即可计算出ERND活性。

自备仪器和用品:

普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水和冰。

试剂组成和配置:

试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加100mL蒸馏水溶解。

试剂二:液体×1瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1管,4℃保存。临用前加1mL蒸馏水,充分溶解。

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加0.5mL蒸馏水,充分溶解。

试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前,加蒸馏水4.5mL充分溶解。

试剂六:液体×1瓶,4℃保存。

试剂七:液体×1瓶,4℃保存。

标准液:液体×1瓶,-20℃保存。临用前取1.5mL EP 管,加入10μl标准液,加990μl蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心30min,取上清液,转入超速离心管中。

2、粗制微粒体:100 000g,4℃,离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。

测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。

3. 对照管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL试剂二,10μL试剂三,10μL蒸馏水,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入35μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A对照管。

4. 测定管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL试剂二,10μL试剂三,10μL试剂四,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入35μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新EP管,加入100μL上清液,100μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A测定管。

5. 标准管:取0.5mL EP管,加入100μL标准品,100μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A标准管。

注意:每个样品都需要做对照管。

ERND活性计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按照蛋白浓度计算:

活性单位定义:37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T

= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr。

(2). 按照样本质量计算:

活性单位定义:37℃下,每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T

= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W

C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:100μL=1×10-4 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样品质量,g;V样:加入粗酶液体积,10μL=0.01mL;T:催化反应时间(min),30min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按照蛋白浓度计算:

活性单位定义:37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T

= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr。

(2). 按照样本质量计算:

活性单位定义:37℃下,每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T

= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W

C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:100μL=1×10-4 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样品质量,g;V样:加入粗酶液体积,10μL=0.01mL; T:催化反应时间(min),30min。

 

 

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