NADPH 氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性
微板法 100 管/48 样>
注 意：正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定
产品简介：
NADPH 氧化酶（NAO）是一个典型的膜蛋白 ，催化 NADPH 氧化生成 NADP+ ， 并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可 导致人慢性肉芽肿病（GCD） ，在植物中 ，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。
NADPH 氧化酶（NAO）将 NADPH 氧化为 NADP+的同时生成超氧阴离子(O2 .- )， 接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂 DPI 排除背 景值。最终检测生成的有色物质在 450nm 处的吸光值，即可计算得出 NAO 酶活性大小。
试剂盒组分与配制：
所需的仪器和用品：
酶标仪、 96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
① 若凝固可放置室温或 25℃水浴溶解。
NADPH 氧化酶（NAO）活性测定：
一、样本制备：
1、 组织样本 ：取约 0.1g 组织 ，加入 1mL 提取液 ，在 4ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各 类常见匀浆器)。离心 10min（ 12,000rpm 4℃) , 取上清作为待测液。
【注】 ：若增加样本量 ，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例进行 提取
2、 细菌/细胞样本 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液 ，超声波破碎细菌或细胞（冰浴 ，功率 200W ，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次） ；离心 10min（ 12,000rpm 4℃) , 取上清 ，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 ）：提取液（mL）为 500~1000：1 的 比例进行提取。
3、 液体样本 ：直接检测；若浑浊 ，离心后取上清检测。
二、实验准备：
1、 酶标仪预热 30min 以上 ，设定温度 37℃ , 调节波长至 450nm。
2、 试剂三的配制：用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分别加 0.55mL 蒸馏水溶解备用。 （用不完的试剂分装后-20℃保存 ，禁止反复冻融 ，三天内用完）
3、 所有试剂解冻至室温（25℃) 。
三、操作测定：
1、NADPH 氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性 在 96 孔板中依次加入：
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试剂名称(μL） |
测定管 |
对照管 |
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样本 |
20 |
20 |
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提取液 |
150 |
145 |
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试剂一 |
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5 |
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37℃孵育 5min（可能会产生沉淀 ，但不影响后续测定） |
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试剂二 |
10 |
10 |
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试剂三 |
10 |
10 |
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试剂四 |
10 |
10 |
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37℃ 避光孵育 20min ，于 450nm 读取吸光值 A， ΔA =A 测定-A 对照。 |
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【注】：若△A 的值在零附近 ，可以延长反应时间 T（如至 40min 或更长） ，则改变后的 反应时间 T 需代入公式重新计算。
结果计算：
2、 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化0.01 为一酶活单 位。
NAO(△OD450/min/mg prot) =ΔA÷(V1×Cpr) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷Cpr
3、 按样本鲜重计算：
酶活定义 ：每克组织每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一酶活单位。
NAO(△OD450/min/g 鲜重) =ΔA÷(W ×V1÷V) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷W
4、 按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一 酶活单位。
NAO(△OD450/min /104 cell) =ΔA÷(500 ×V1÷V) ÷0.01÷T
=0.5 ×ΔA
V---加入提取液体积 ， 1mL；
V1---加入样本体积 ，0.02mL；
T---反应时间 ， 20min；
建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
W---样本质量 ，g；
500---细胞或细菌总数 ，万；
Cpr---样本蛋白质浓度 ， mg/mL；
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预实验的意义： 比色法检测试剂盒预实验非常重要 1、确定该试剂盒是否适合客户的样本检测 ，以免造成试剂盒和样本的浪费（比如低表达 处理的样本）； 2、熟悉生化试剂盒的操作流程 ，尤其是初次使用生化试剂盒测定； 3、确定样本的处理方法及稀释倍数是否合适； 4、了解实验过程中可能出现的实验现象或问题 ，以便于及时作出调整； 5、通过 3 - 5 组预实验 ，判断试剂盒对于样本的最佳适应稀释浓度范围 ，指导实验样本 稀释比例。 |
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资料/datasheet
