硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理
NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样本前处理
动植物组织样品的前处理:
（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注意：
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管或96孔板中加入下列试剂）
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试剂名称（μL） |
加样孔 |
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测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
|
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样本 |
20 |
20 |
|
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0.1μmol/mL标准液 |
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20 |
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蒸馏水 |
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75 |
|
95 |
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试剂一 |
75 |
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75 |
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试剂二 |
25 |
25 |
25 |
25 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）反应30min
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试剂三 |
50 |
50 |
50 |
50 |
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试剂四 |
50 |
50 |
50 |
50 |
混匀，25℃室温显色20min，540nm处比色
注意：1、标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。
2、诱导处理后的样本对照管中试剂二改成加25μL蒸馏水。
NR活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/g 鲜重）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/mg prot）=(C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
C标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.02mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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资料/datasheet
