因素类别

具体因素

如何影响灵敏度

试剂与材料

抗体亲和力

高亲和力抗体能更牢固地结合目标物，显著提高信号强度和检测下限。

酶标抗体活性

酶（如HRP）失活或抗体效价低会直接导致信号减弱，造成显色淡、灵敏度低。

包被抗原/抗体浓度

浓度过低导致结合位点不足；过高则可能引起空间位阻或非特异性吸附。

固相载体

不同类型的微孔板（如高结合力聚苯乙烯板）对蛋白的吸附能力不同，影响包被效率。

样本处理

溶血

红细胞释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性，会催化底物产生非特异性显色，干扰结果，可能导致假阳性。

脂血

样本脂肪含量过高会干扰抗原抗体反应，可能造成假阴性。

黄疸

胆红素等物质可能含有内源性过氧化物酶，产生非特异性干扰。

反复冻融

机械剪切力会破坏蛋白质结构，导致抗体效价下降或抗原降解，降低检测信号。

内源性干扰物

类风湿因子(RF)、补体、异嗜性抗体等可与试剂中的抗体非特异性结合，增加背景噪音。

操作过程

孵育时间与温度

时间不足或温度偏低会降低抗原抗体结合效率；时间过长则可能增强非特异性反应。

洗涤步骤

洗涤不充分会残留未结合物质，增加背景；洗涤过度或缓冲液不当可能洗脱已形成的复合物。

加样操作

加样量不准、气泡、交叉污染或使用被污染的枪头都会引入误差。

试剂平衡

试剂未在室温平衡即使用，温度差异会影响反应动力学。 

检测系统

检测方法

化学发光法通常比比色法（如TMB）更灵敏；荧光法也具有较高灵敏度。

酶标仪性能

仪器的光学系统（滤光片、光路）和软件算法直接影响读数的准确性和精密度。