首次培养的细胞，是直接从机体组织分离后得到的原代细胞，其生物学特性跟体内状态最为相近，是基础生命科学研究里不可缺少的重要工具，正确理解并掌握它的制备与培养技术，跟实验数据的可靠性以及研究结论的科学价值直接相关。

原代细胞怎么获得

第一步是决定原代细胞质量的组织样本采集，动物或人体组织离体后，必须在最短时间之内进入处理流程，通常不超过半小时，不然细胞活性会迅速下降，采集过程中，使用含有双抗的平衡盐溶液反复冲洗，能够有效去除表面微生物并维持组织湿润状态，不同组织类型需要采用不一样的分离方法，实体组织常用酶消化法或组织块贴壁法，而如外周血这样的液体样本则通过密度梯度离心分离单个核细胞。

目前应用最为广泛的组织分离技术是酶消化法，富含胶原纤维的组织比如肝脏、肺脏适用胶原酶，而处理胚胎组织或者肿瘤组织胰蛋白酶则更为合适，消化的时候必须精确控制酶浓度以及消化时间，一般是在37℃水浴或者培养箱里持续搅拌30至60分钟，每隔15分钟取样进行观察，当在显微镜下能够看见单细胞或者小细胞团块时要立刻终止消化，过度消化会严重损伤细胞膜结构。

原代细胞培养的关键点

原代细胞的存活与增殖直接由培养体系的优化所决定，基础培养基要按照细胞类型选择，像是DMEM适合成纤维细胞，RPMI - 1640对淋巴细胞生长更有利，培养过程中胎牛血清的质量十分关键，建议通过对批次进行筛选来找出最适宜的血清，且血清浓度通常控制在10%至20%这个区间，其次原代细胞对生长因子的依赖程度较高，常常需要额外添加EGF、FGF等特定因子用以维持细胞正常分裂。

要维持原代细胞功能，培养环境模拟是保障，原代细胞对pH值变化很敏感，对渗透压变化也很敏感，培养箱里二氧化碳浓度得精确维持在5%左右，湿度要达到饱和状态，用来防止培养基蒸发，换液频率一般是每2-3天一回，不过实际操作时要依据培养基颜色变化以及细胞代谢状态灵活调整，首次换液最好在细胞贴壁后24小时实施，目的是去除未贴壁的细胞以及细胞碎片。

原代细胞冻存怎么做

原代细胞长期保存的核心环节在于冻存液的配方选择，二甲基亚砜为目前公认最有效的渗透性保护剂，其使用浓度通常是5%-10% ，它可迅速渗透细胞膜以防止冰晶形成，胎牛血清作为非渗透性保护剂发挥蛋白质保护作用，二者按9:1的比例同基础培养基混合，能形成高效的细胞冻存体系，近年来无血清冻存液也渐渐普及，可减少批次差异所带来的不确定性。

决定冻存细胞复苏存活率的是降温速率控制，原代细胞最理想的降温速率是每分钟下降1℃直至达到-80℃，这得在程序降温仪里完成，或者采用4℃30分钟、-20℃2小时、-80℃过夜的分步冻存方式，长期保存得转移至液氮罐气相中，温度要维持在-196℃以下，复苏时采用37℃水浴快速解冻，时间控制在1分钟内，解冻后马上用预温培养基缓慢稀释去除保护剂，操作过程要轻柔防止机械损伤。

于开展原代细胞实验之际，您有没有碰到过因操作方面的细微之处致使细胞状态不太好的情形呢，欢迎来评论区域分享您的应对经验。