PCR扩增实验试剂盒属分子生物学实验室的基础性工具，它把复杂的聚合酶链式反应所需构成部分预先进行了混合，极大地简化了操作过程。身为实验人员，对试剂盒的组成以及使用方面的详情加以理解，会直接对扩增结果的可靠性和重复性产生影响。接下来从几个常见问题着手，分享实际工作期间的经验。

试剂盒主要成分有哪些

具有标准特性的PCR扩增实施实验所使用的试剂盒，一般涵盖DNA聚合酶，dNTPs，发挥反应调适作用的缓冲液，还有镁离子溶液。部分呈现预混样式的试剂盒，还会增添优化剂以及稳定剂，像明胶或者 Tween 20 这类物质。不同品牌在组分具备的浓度，连带添加剂范畴有着不同差异情况，这直接对扩增具备的特异性以及灵敏度起到决定性作用。将包装拆开以后，建议先去核对说明书之中的成分详尽清单，以此避免出现遗漏状况。

缓冲液里的pH值以及盐浓度，对于酶的活性起着极重要的作用，另外镁离子浓度，更是那影响引物跟模板结合的关键变量，某些试剂盒会把镁离子单独给分装起来，以便于能够依据实验的需求去进行调整，除此之外对照试剂像是阳性对照以及阴性对照，在盒子里面也是较为常见的，可用来验证体系是不是能够正常地工作。

如何选择PCR试剂盒

当你在选择PCR扩增实验试剂盒之时，首先得明确你所拥有的模板类型，是普通DNA呢，还是cDNA，亦或是富含GC的序列。要是针对于长片段，也就是超过5kb的，或者是高GC含量的模板，那就需要选用专门来设计的那种聚合酶以及反应缓冲体系。普通的Taq酶试剂盒适合进行短片段的扩增，然而高保真试剂盒是被用于克隆测序等那些需要低错配率的场景之中的。

首先得说，试剂盒的储存条件以及保质期是接下来需要着重予以关注的要点所在。大多数不同类型的试剂盒明确规定，必须放在零下二十摄氏度的环境当中进行冷冻保存，需要注意的是，多次进行冻存与解冻的操作，必然会使得酶活出现降低的情况。然而，如果一间实验室不具备能够进行冻存的条件，那么就可以选择那种在四摄氏度环境下具备稳定性的改良型试剂盒。除此之外，预混型也就是二倍的主混合物，其在使用方面更为便捷，仅仅只需要添加引物、模板以及水就可以了，这种类型特别适合应用于高通量的实验之中。

PCR扩增实验注意事项

进行操作时，最难被留意到的便是防污染方面。PCR扩增实验试剂盒具备极高敏感性，空气中存在的气溶胶、操作台上留存的残留模板全都有可能致使假阳性产生。提议分区域来进行试剂配制、样本添加以及产物检测，而且要运用带有滤芯的移液枪头。每次开展实验都得设置无模板对照，以此来监控污染状况。

另一个关键之处在于，退火温度的设定。即便试剂盒给出了推荐温度，然而实际的最佳退火温度，依旧会因为引物序列的不同而有所差异。可以利用梯度PCR仪，在55至65℃这个范围进行测试，从而找到扩增条带最为明亮，并且不存在非特异性条带的那个温度。另外，延伸时间需要依据目标片段的长度来进行调整，通常而言，每kb设置30至60秒，要是过长的话，容易出现弥散条带。

提高扩增效率技巧

是在扩增产量呈现偏低状况或者条带微弱的时候能尝试一下调整反应循环数，一般而言30到35个反应循环就把足够检测给涵盖了，然而低拷贝模板是能够把循环数增至40个的，并且还要检查模板质量，纯度差的DNA是会抑制聚合酶活性的，建议运用核酸纯化柱重新提取，另外添加5%的DMSO或者甜菜碱能够有助于打开二级结构，这是适合高GC模板的。

如果出现了引物二聚体，那么这表明引物设计或许存在问题，又可能是退火温度相对偏低。在这时，应当重新去设计引物，要让其二聚体的Tm值相近，而且还要避免3’端出现互补的情况。也能够运用试剂盒里的镁离子浓度，从1.5 mM开始一步步地提升至2.5 mM，去观察二聚体是否会有所减少。要记录下每次优化的参数，逐渐构建起适配自己体系的标准化流程。