细胞培养如何避免污染

细胞培养时，污染乃是最为常见的致使失败的缘由，要预防污染就得始终坚持无菌操作，在使用之前，要用百分之七十五的酒精去擦拭生物安全柜，一切耗材都要历经高压灭菌或者辐照处理，进行操作之际，要身着洁净的实验服，戴上手套，尽可能地防止手臂横向越过开口的容器，向培养基里添加百分之一的双抗能够抑制细菌，然而对于支原体却没有效果，因此需要定期运用PCR法去检测。

倘若察觉到污染迹象，像培养基呈现浑浊状态，或者pH发生变色情况，又或者细胞出现漂浮脱落现象，那就应当即刻将其丢弃，并且对培养瓶进行消毒处理。千万别去尝试借助抗生素来“拯救”，因为那样做只会把问题给掩盖住，还会滋生出耐药菌。培养箱的水盘每周都要替换成无菌水，还要添加硫酸铜，以此来防止霉菌滋生。建议确立“一人一瓶”的原则，防止因交叉使用试剂而导致批量污染发生。

细胞培养传代的最佳时机

在细胞融合度触及80% - 90%之际传代是最为适宜的，要是传代过早，细胞数量少且呈现生长缓慢的态势，而过晚传代的话，会因接触抑制致使老化或者分化的情况发生。需观察倒置显微镜：看到贴壁细胞间隙消失、开始重叠之时就要展开行动。对于悬浮细胞而言，当密度达到1×10^6个/ml的时候进行传代，不然代谢废物积累会对细胞活性造成毒害。

用于传代的标准步骤是，先把旧培养基吸掉，接着用预热过的PBS清洗一到两次，以此来去除血清残留。之后加入胰酶，使其覆盖细胞层，在37℃的环境中进行消化，消化时间为一到五分钟，不同的细胞系存在的差异十分显著，比如293T细胞仅仅需要一分钟，而成纤维细胞则需要五分钟。当在显微镜下看到细胞变圆，并且轻轻晃动时细胞就能够脱离时，要马上加入含有血清的培养基来终止。而后用吸管轻柔地吹打十到十五次，按照1:3的比例接种到新的瓶子当中。

细胞培养常用培养基怎么选

要选择基础培养基，这取决于细胞类型。DMEM高糖型，适合那种快速增殖的HeLa、CHO细胞。而低糖型呢，适合代谢比较慢的原代成纤维细胞。RPMI - 1640是专门为悬浮细胞设计的，像淋巴细胞以及白血病细胞系就是这类。能用于神经元、再或者上皮原代细胞的是MEM和F - 12。成本较高但是蛋白表达适宜的无血清培养基类为CHO - SFM。

血清一般添加10%胎牛血清，部分特殊细胞得额外补充谷氨酰胺、丙酮酸钠或者非必需氨基酸。购买培养基之际优先挑选液体成品，防止自己配制粉剂导致批间差以及pH波动。分装成50ml小管存放在4℃，防止反复加热。使用之前观察颜色，正常酚红指示剂呈现鲜红色，偏紫或者偏黄表明pH异常，不宜再使用。