用于分子生物学实验的，常用的，拥有着高灵敏度特性的检测技术，是探针法荧光定量PCR。它借助于特异性荧光探针，在扩增进程里发出信号，以此能够对目标序列的扩增情形进行实时监测。和染料法相比较而言，在多重检测以及特异性这两方面，探针法更具备优势。

探针法荧光定量PCR原理是什么

核心在于使用一条荧光标记探针来进行探针法，该探针与目标序列互补，其一端连接报告荧光基团，而另一端连接淬灭基团，当探针保持完整状态时荧光会被淬灭，在PCR退火阶段探针会和模板相结合，此阶段过后进入延伸阶段，这时DNA聚合酶的外切活性会把探针切断，如此一来报告基团便会远离淬灭基团进而发出荧光，荧光强度和扩增产物量成的是正比关系，借助标准曲线能够实现绝对定量。

探针设计有哪些注意事项

探针的长度通常被控制在二十到三十个碱基，其Tm值比引物要高五到十摄氏度。要防止探针自身形成发夹结构或者二聚体，并且探针的GC含量以百分之四十到百分之六十为适宜。五端不能是G碱基，原因在于G会使荧光信号淬灭。同时要做到确保探针和模板结合位置完全匹配，单碱基错配很可能致使信号大幅度下降。运用专业软件比如Primer Express或者Beacon Designer能够提高设计成功率。

如何优化反应体系提高灵敏度

通常情况下，模板投入量是在10至100 ng这个范围，要是过少的话，那么Ct值就会偏大，要是过多的话，有可能会抑制反应。引物浓度方面给出的建议是0.2至0.4 μM，探针浓度则是0.1至0.2 μM。采用热启动Taq酶能够减少非特异性扩增。退火温度要比探针Tm值低5至10℃，延伸时间30秒就可以了。添加低浓度ROX作为校正染料能够消除背景波动。每次实验都要设置无模板对照以及标准品梯度，以此来确保结果可靠。

结果异常时如何排查问题

要是扩增曲线呈现出非特异性峰，首先得去检查引物二聚体，对引物重新进行设计或者把退火温度给提高。要是阴性对照出现了信号，有可能是试剂被污染或者探针发生降解，需要将所有组分进行更换。当荧光信号过低的时候，要增加模板量或探针浓度，与此同时要确认荧光基团与仪器检测通道相匹配。对于多重反应而言，不同探针之间需要借助交叉验证来避免光谱重叠造成干扰。