细胞培养，作为生物实验室里极为基础且特别核心的技术当中的一项，其含义是在人工加以控制的条件之下，使得细胞能够实现生长与繁殖。不管是蛋白的表达，还是病毒的扩增，均需仰仗稳定且可靠的培养体系。就在今天，依据多年实际操作所积累的经验，来谈论那些容易被人们忽视但实则至关重要的细节。

细胞培养需要哪些基本条件

首要前提是无菌环境，超净工作台在使用之前，要进行紫外照射三十分钟，并且要用酒精擦拭台面。培养液需要含有氨基酸，还需要含有维生素、无机盐以及生长因子，哺乳动物细胞常用的是 DMEM 或 RPMI - 1640 基础培养基。温度要严格被控制在 37℃，CO2 浓度要维持在 5%，以此来调节 pH 值，酚红指示剂显示淡红色才是正常状态。

对于水质而言，得用超纯水亦或是去离子水才行，要防止重金属以及细菌内毒素造成干扰。贴壁细胞的话，得要有经过表面处理的培养瓶，只有带正电荷才能够良好地附着。血清一般添加10%的胎牛血清，不过根据细胞类型是可以调整比例的。所有像移液管、离心管这样的耗材，都需要进行灭菌或者使用一次性无菌产品。

如何防止细胞培养污染

表现为培养基快速变黄且浑浊、伴有酸臭味现象的事物是细菌污染，呈现出絮状菌丝状况的则为真菌。预防这些污染的首要原则乃是严格进行无菌操作，在操作之前，需用75%酒精去擦拭双手以及台面，器材开口之后要迅速采用火焰灭菌或者立即予以使用。那种在培养基里添加双抗的做法，仅仅能够抑制部分杂菌而已，绝对不可以替代规范操作。

支原体污染不容易被察觉出来，需要每个月采用PCR法去检测培养上清。交叉污染一般是源自于同时对多种细胞进行操作，每一种细胞系都应该使用独立的移液管以及培养基，防止共用。一旦发现污染瓶要马上进行隔离，使用84消毒液处理台面和培养箱的内壁，情况严重的时候要解冻新批次的细胞然后重新开始。

细胞传代与冻存的正确方法

贴壁细胞生长，当融合至80% - 90%那一刻就不得不迅速传代。要是不传代，就怕接触抑制会致使加速老化。首先要把旧培养基吸弃掉，接着用PBS缓冲液清洗两次，以此清除残留血清。随后，要加入0.25%胰蛋白酶 - EDTA消化液，在37℃的环境中孵育1 - 3分钟。当在显微镜下看到细胞变圆，并且开始脱离瓶底的时候，要在当下毫不迟疑地用含血清培养基去终止消化。然后轻轻地吹打，使得制成单细胞悬液，按照1:3的比例分装到新的培养瓶当中。

对于冻存，要配制含有百分之十DMSO的冻存液，采用梯度降温方式，先是在四摄氏度放置三十分钟，接着在零下二十摄氏度放置一小时，然后在零下八十摄氏度过夜，之后再转入液氮罐。而复苏时，要快速从液氮处取出，在三十七摄氏度水浴进行融化，马上加入预热后的培养基用以稀释DMSO，经过离心去除冻存液之后再去接种。每一次操作都要记录细胞代数、冻存日期以及类型，良好的传代习惯可以让细胞长久维持稳定状态。