为什么我的细胞株总是状态不好？

我有个朋友叫老陈，在苏州一家生物技术公司负责上游工艺开发。

明明讲的是“工艺开发”，然而实际上，每日与细胞株打交道所耗费的时间，相较于与家人相处的时间还要更多呢。

他时常跟我述说不满：“培育细胞恰似照管小孩，你投入十足的心思，它不见得会给予你十足的回馈；然而稍有一点不小心大意，它就会死在你面前给你作一作样子瞧。”。

今年年初，公司接了个新项目，要做一款重组蛋白。

老陈负责筛选和生产用细胞株。

当时，他手上有一个现成的CHO - K1细胞株，此细胞株是从国内一家供应商那里购买得到的，其传代记录书写得极为清晰明白，而且冻存管上面的标签也是规规矩矩、整整齐齐的。

他觉得问题不大，直接扩增培养，准备做瞬时转染测试。

话说在结果转染之后的第三天，他去查看细胞状态，这一看，差点没直接把培养瓶给扔出去，为啥呢？因为此时细胞呈现出聚集成团的状况，并且其边缘并不清晰，而且能肉眼明显看出细胞活力在往下降喽。

他赶紧做了台盼蓝染色，计数仪一报：活力只有68%。

正常CHO细胞转染后活力怎么也该在85%以上。

老陈心里咯噔一下。

他检查了培养基、二氧化碳浓度、温度，都没问题。

又做了支原体检测，阴性。

细胞株身份鉴定有必要做吗？

他开始怀疑细胞株本身。

说实话，很多做工艺的人不太重视细胞株的“身份”。

大家默认买回来的细胞就是对的，传代过程中也不会出错。

但是，老陈先前听闻有一位前辈讲过这样的话语，是什么话语，那就是你始终都没办法晓得，在前一个人进行操作期间，是不是存在拿错冻存管的情况。

他翻出那批细胞的入库记录。

入库的时间呢，是在2025年11月这个阶段，那时仅仅进行了活力检测，以及支原体检测，然而并没有去做短串联重复序列鉴定。

关于短串联重复序列的鉴定，这属于细胞株进行“DNA指纹”方面的内容，通过它能够确认该细胞株究竟是不是人们期望得到的细胞株。

老陈送了几份样品到第三方检测机构。

等了三天，结果出来了，他一下子傻了眼，细胞株的短串联重复序列图谱，和CHO - K1标准图谱，存在三个位点不匹配的情况。

就是说，他喂养了三个月之久的那个“CHO-K1”，事实上压根就不是CHO-K1，没错吧。

可能是在传代这个过程当中，混入了别的细胞，也可能是供应商在当初的时候，就标错了。

老陈给我打电话的时候，声音都是哑的。

他说：“三个月，几十瓶细胞，几千毫升培养基，全白干了。”

更麻烦的是，他用这批细胞做的瞬转表达数据，全部作废。

项目进度直接倒推三个月。

如何挑选靠谱的细胞株供应商？

那段时间老陈天天带着团队重新筛选细胞株。

他这次学聪明了，不贪便宜也不图省事。

他列了一份供应商评估清单。

看供应商是否提供短串联重复序列鉴定报告。

正规的细胞株供应商，每一批次的冻存管在出厂以前，都要去做短串联重复序列鉴定，鉴定之后报告将会随着货物一起发出。

看传代历史记录。

对于好的供应商而言，会将细胞株的来源清晰地进行标注，会明确最初分离的时间，会说明已传代的次数，会表明有无克隆筛选这一过程。

后来，老陈选取了一家作为美国ATCC官方代理的机构，尽管与之前那家相比，其价格翻了一番，然而，每一管进行冻存的细胞，皆附带有着完整的鉴定文件以及质检报告。

看支原体、细菌、真菌检测结果。

他特地向供应商提出要求，要其给出最近三个月的环境监测方面的数据，以及批量放行的检测结果。

存有一些小供应商会取用半年之前制作的报告以此来充当实际情况，然而细胞株要是在了液氮之中摆放的时间比较久远，要是管壁密封性出现了问题，那么在解冻之后依旧会遭受污染。

此次老陈挑选得出的供应商那头，针对所提供的每一批冻存管，均开展了直接培养法以及荧光染色法这样两种方式的支原体检测操作，只有检测结果呈现为阴性状态的情况下，才会予以放行处理。

细胞株传代操作有哪些容易忽略的细节？

细胞株买回来只是第一步。

老陈重新梳理了细胞房的操作规程。

以前他为了省时间，一个生物安全柜里同时操作两三个细胞株。

尽管采用了各异的移液管，然而空气的流通以及飞溅的风险实际上没办法做到全然隔离。

有一回，他弄完A细胞株后，手套的表面兴许沾附上了细胞悬液，随后没有更换手套便径直去拿B细胞株的培养瓶，最终交叉污染竟如此这般地出现了。

现在他规定：一个生物安全柜同一时间段只操作一个细胞株。

操作完彻底清洁台面，紫外照射至少15分钟，才能换下一个。

他给每一个细胞株都配备了专门用于培养的瓶子，以及专门用于酶解细胞的那种瓶子，这两种都是专用的，在瓶子的身上，用带有不同颜色的那种标签来进行区分。

培养基，每次仅去分装出一周的用量，剩余的，锁在专门的冰箱里头，防止反复开启从而造成污染。

传代时，他要求所有操作必须在火焰旁进行。

瓶口过火不能少于三秒，移液管不能碰到瓶口外壁。

听上去全都是基本功，然而呢，从事工艺的那些人都清楚，接连进行操作十次不出现差错是比较容易的，而连续操作一百次都不出现差错则是困难的。

在2026年1月12日，那个时候老陈，由于着急去做一批转染，在传代之际，手速过快，没有等到酒精挥发完毕，就开启了瓶盖，结果呢，那一批一共整六瓶的细胞，全部都被染上了霉菌。

显微镜下能清楚看到菌丝。

他后来在记录本上写了一句：“快就是慢，慢就是快。”

细胞株冻存和复苏怎样保证高活率？

细胞株冻存复苏的细节，老陈以前不太在意。

他觉得液氮温度够低，细胞扔进去就行。

可是有一回，他从液氮罐当中拿出一根冻存管，紧接着直接丢进37度的水浴锅，结果呢，管壁由于温差过大，一下子就爆裂了。

细胞悬液溅得到处都是，不仅细胞没了，还差点污染整个水浴锅。

后来他专门去请教了一位有十几年经验的上游工艺专家。

专家告诉他几个关键点：

冻存时，细胞要处于对数生长期，活力不低于95%。

用于冻存的液体是由百分之九十的胎牛血清以及百分之十的二甲基亚砜所构成的，添加二甲基亚砜的时候呢，需要缓慢地进行滴加操作，在滴加的过程当中还要一边进行摇晃动作，以此来避免局部的浓度过高进而对细胞造成损伤影响。

放入程序降温盒的冻存管，于-80度冰箱放置过夜，接着，第二天再将其转入液氮气相存储层。

直接扔入液氮液相是绝对不行的，因为液相温度为零下一百九十六度，那儿降温速度过快，细胞内部冰晶会将细胞膜刺破。

在进行复苏操作时，要从液氮之中把冻存管取出来，随后马上将其放置到37度的水浴锅里面，接着轻轻地进行摇动，当管底最后那一小块冰融化掉之后就立即把它取出来。

采用75%酒精对管壁予以擦拭，随后，于生物安全柜之中，把细胞悬液缓缓地添加至预热好的培养基里。

培养基里最好加10%胎牛血清，帮助细胞修复冻存损伤。

老陈依照这个办法，于2026年2月18日，使一批新的CHO - S细胞株得以复苏。

解冻后活力检测，93%。

他当时差点哭出来。

细胞株稳定性测试到底该怎么做？

细胞株筛选出来后，老陈没有急着做大规模生产。

他先做了稳定性测试。

好多人觉得细胞株批与批之间，表达量保持稳定就可以，然而在实际的操作进程当中，细胞株于传代的过程里，会出现遗传漂变的情况。

尤其是超过30代以后，有些克隆的优势生长会改变群体特征。

老陈的做法是：从原始细胞库取一支冻存管，扩增建立主细胞库。

主细胞库分装100支冻存管，全部保存在液氮气相。

然后从主细胞库取一支，扩增建立工作细胞库。

工作细胞库同样分装100支。

每次生产前，从工作细胞库取一支复苏，连续传代到目标代次。

他提出要求，针对于细胞株，要在目标所处的代次范围之内，每隔5代时，进行一次取样操作，以此来检测表达量以及产物质量。

确切的做法如下：于第0代的时候进行瞬时转染，在第5代的时候开展瞬时转染，在第10代的时候搞瞬时转染，在第15代的时候去做瞬时转染，于第20代的时候实施瞬时转染，进而去检测目标蛋白那种物质的表达量，以及聚体、碎片等这些关键质量属性。

如果任意两个代次之间，其表达量的变化超出了百分之二十，又或者质量属性呈现出显著有别的状况，那么这批细胞株就无法被用于生产。

2026年3月初时，老陈完成了一组测试，他的CHO-S细胞株，到第 20代的时候，表达量仅仅下降了8%，并且聚体比例一直控制在3%以下。

这才松了口气。

细胞株污染后除了扔掉还能怎么办？

但好事多磨。

2026年4月中旬，老陈的细胞房再次出现污染。

这次不是霉菌，而是细菌。

相继有三瓶处于工作状态的细胞库中的细胞，在经过解冻操作的次日，培养基随即出现变浑浊的情况，紧接着pH值从7.2下降至6.5以下。

老陈没有急着把细胞全扔了。

他先取了污染液做涂片和生化鉴定。

鉴定结果是表皮葡萄球菌。

他推测是操作人员在生物安全柜里说话时，飞沫掉进了培养瓶。

富有经验的工艺方面的人，会对你讲告知，轻微程度的细菌被污染这种情况，实际上是能够采用抗生素来进行处理，借此实现挽救的。

但老陈不建议这么做。

因为抗生素处理会改变细胞代谢状态，后续的表达数据不可靠。

而且一旦你习惯了用抗生素，就会放松无菌操作的要求。

所以他直接销毁了所有受污染的细胞株，重新从主细胞库复苏。

就在同一时刻，他对整个细胞房展开了彻彻底底的清洁，先是运用杀孢子剂去擦拭整个细胞房里的所有台面，接着擦拭培养箱的内壁，然后擦拭离心机的转子，最后擦拭水浴锅。

培养箱的水盘换成无菌纯水，每周更换一次。

生物安全柜的HEPA过滤器也请厂家做了检漏。

2026年4月25日，当所有事情都准备妥当之后，他再度使一瓶工作细胞库的细胞恢复了生机。

这次他格外小心，连移液器都换了一套新的。

三天后细胞长满，活力97%，镜检无任何污染迹象。

老陈说，这一个月虽然折腾，但值。

他现在对细胞株的理解，比过去三年加起来都深。

细胞株管理的SOP一定要写清楚什么？

老陈最后把这段经历写成了一份内部SOP。

他告诉我，SOP里最容易被忽略的是异常处理流程。

大多数SOP只写“正常怎么做”，不写“如果出错了怎么办”。

他特意加了几条：

针对细胞株身份鉴定，每半年会开展一次短串联重复序列检测，若检测结果不通过，那么相关细胞株将被直接进行销毁。

细胞房出现的污染事件，得将其记录下来，要记录污染发生的时间，记录污染的菌种是什么，记录造成污染的可能原因，还要记录相应的整改措施。

任何细胞株传代超过30代后，必须重新做稳定性测试。

冻存管标签必须用耐液氮的防水标签，手写标签一律禁止。

他还规定，每个人只能操作自己负责的细胞株，不能跨项目操作。

每月，每个人都要进行一回无菌操作的考核，在显微镜下分辨出三种常见的污染菌，即霉菌，酵母菌，还有杆菌。

不合格的暂停细胞房操作权限，重新培训。

这份SOP在2026年4月28日通过公司审核，正式生效。

上个月我去苏州找他吃饭，他整个人精神状态都不一样了。

他讲当下每日在进入细胞房之前，会于门口站立五秒钟，对自身的手套、口罩、袖口、头罩予以检查。

然后推门进去，关上门，不说话，只干活。

三个月前那批报废的细胞株，现在想起来还是会心疼。

不过他讲，要是没有那一回的教训，他或许直至如今还会认为细胞株能够随意购买、能够随意培养就可以了。

有些路，自己不摔一跤，别人说破嘴皮子也没用。

他最后跟我说了一句话，我觉得特别实在：

拿细胞株这个事儿来说，能用钱搞定的统统都不算啥难题。难题在于那些用钱搞不定的方面，像你的习惯，再者是你的细心程度，还有你对规则所抱有的敬畏之心。

如若你同样在从事细胞株关联的工艺开发方面的工作，那么建议你回过头去瞧上一眼你所拥有的细胞库鉴定报告，以及你所做的传代记录，还有你的污染处理标准操作程序。

别等到数据全废、项目延期才后悔。

那一份SOP，是老陈发给我的，有需求的朋友，要是可以私信我，那我会转发给你。