兔原代细胞

为什么朋友说兔原代细胞分离总卡在第一步

我认识老张有五年了，他在一家生物技术公司负责细胞实验板块。

前段时间他接了个新项目，需要用到兔原代细胞做基础研究。

原本觉得这件事情并不是很难，但是呢，老张接连不断地折腾了两星期，然而最终竟然是连一管达到合格标准的细胞都没有获取到。

他给我拨通电话之际，嗓子已然沙哑，声称，“明明是依照标准步骤行进，然而细胞却并不帖壁”。

2026年3月中旬，我在老张的实验室见到了他。

桌上摆着几只新西兰兔的组织块，培养箱里几瓶混浊的培养基。

他指着其中一瓶说：“你看，这已经是第四次了，全部污染。”

我向他询问具体是怎样进行操作的，老张针对流程讲述了一回，问题于即刻呈现了出来。

兔原代细胞分离时最容易忽略的细节

老张用的是兔肾脏组织，想分离肾皮质原代细胞。

他第一步就把组织剪得太碎，虽然这样消化快，但细胞损伤也大。

我于一旁瞧着他进行操作，他所采用的是百分之零点二五的胰酶，其消化时间被把控在二十分钟。

实际上，兔子的组织结构是相对易于受到损害的，在相关的学术资料当中，所给出的建议是采用浓度为0.125%的胰酶与胶原酶相互搭配使用。

老张没注意这个差异，结果每次离心后活细胞率都不到40%。

2026年3月22日那天，我建议他换一种消化方案。

先将胰酶的浓度把它降低到0.1%，之后再去添加0.5mg/ml的胶原酶IV型，是这样的操作流程。

消化温度也从37度降到35度，时间延长到30分钟。

老张带着半信半疑地神情进行了一回尝试，在借助镜子观察期间，显著地察觉到细胞的状态改善了许多。

还有一个坑是培养基的pH值和渗透压。

兔原代细胞对酸碱度很敏感，市面上通用的DMEM需要调整。

老张之前直接买成品高糖DMEM，没测pH直接就用。

我致使他借助pH计将数值调节到了7.2，把渗透压把控在大约290 mOsm/kg的范围之内。

这一步改完之后，细胞贴壁率从不到30%提升到了65%以上。

如何判断你提取的兔原代细胞能不能用

老张第一次拿到贴壁细胞时特别兴奋，但第二天一看又不对了。

细胞是长出来了，然而其形态却是杂乱无章的，存在着这样的情况，有的呈现出梭形，有的呈现出多角形。

他问我：“这到底是不是我要的肾小管上皮细胞？”

我让他做了个简单的鉴定：用CK-18抗体做免疫荧光染色。

结果是阳性的细胞不到50%，说明混入了大量成纤维细胞。

这是兔原代细胞提取中的常见问题——杂细胞过多。

老张反思了一下，问题出在组织块消化后的筛网过滤环节。

他所使用的，有着100目规格的筛网，其孔径尺寸过大，致使成纤维细胞，与小管碎片，完全混杂在了一块儿。

我建议他改用200目和400目两层筛网依次过滤。

2026年4月3日，老张按照这个新方案重新做了一遍。

这一回，他耗费了比以往多出一个小时的时间，将经过消化之后所得到的悬液，先是拿去通过200目的筛网，而后又拿去通过400目的筛网。

400目筛网能截留大多数成纤维细胞和间质成分。

滤下来的液体再离心，沉淀重悬后接种。

第二天观察，视野里基本是均一的鹅卵石样细胞。

他做了流式鉴定，CK-18阳性率超过了85%。

兔原代细胞培养三天就飘起来的原因找到了

细胞被分离出来之后，老张觉得所有事情都圆满顺利了，然而在培养工作开展到了第三天的时候又出现异常情况。

原本贴得好好的细胞开始慢慢飘起来，培养基也变黄很快。

他换了新鲜培养基，依然止不住细胞脱落。

这其实是很多初学者容易忽视的环节——换液时机不对。

2026年4月10日，我陪他一起做了个对比实验。

第一组在种板后24小时就换液，第二组等到48小时才换。

结果24小时换液的那组，细胞飘了将近一半。

因为兔原代细胞分泌的细胞外基质需要时间沉积。

过早换液会把刚铺展的基质冲掉，细胞自然待不住。

老张后来改成接种后48小时内不动培养瓶，只轻轻补加培养基。

三天后首次半量换液，之后每两天换一次，每次只换一半。

飘起来的细胞大大减少，到了第七天已经长到80%汇合度。

他另外发觉兔原代细胞并不需要常常观察，而每一次将其从培养箱拿出来的时候，都会对温度造成扰动。

后来他索性把培养瓶放进三气培养箱，氧浓度调到5%。

这样一来，细胞的长势更稳定了。

做兔原代细胞一定要避开这几种试剂

老张以前养细胞不挑试剂，实验室有什么用什么。

但兔原代细胞对某些添加剂特别敏感，比如抗生素。

他之前一直加青霉素-链霉素双抗，浓度是100U/ml。

某一回，他察觉到添加了双抗的细胞生长速度迟缓，在将其换成无抗培养基之后，细胞生长状况恢复了不少。

后来查资料才知道，兔细胞对青霉素的耐受度比鼠细胞低。

2026年4月，处于中旬时段，老张特意去采购了几样物品，这些物品是适合兔原代细胞的。

胎牛血清换成特级款，并且用了透析过的血清。

加了EGF的生长因子，加了胰岛素的生长因子，其浓度分别被控制在10ng/ml，其浓度分别被控制在5μg/ml。

消化时用的TrypLE替代了胰酶，对细胞膜损伤更小。

这些改动看起来不起眼，但累计效果特别明显。

他还在培养瓶底预铺了I型胶原，帮助细胞更快贴壁。

采用了这些举措以后，兔源的原代细胞，从进行提取开始，一直到实现传代，所经历的时间，减少了整整两天。

老张说早知道这些细节，之前那三周就不至于白折腾。

兔原代细胞污染后别急着扔 先做这一步

做原代培养最怕污染，老张也中过招。

有一次培养皿里出现了絮状物，培养基变浑浊。

他本打算全部扔掉，我劝他先做一下鉴别。

取一点培养液涂片，革兰氏染色后镜下看见的是杆菌。

这提示可能是操作时带进去的环境细菌。

2026年4月20日，老张遇到了一次真菌污染。

培养基没变浑，但出现了白色菌落，还有一丝霉味。

他这回变得机灵了，并非将所有的都舍弃掉，而是把那处在污染孔旁边的状态良好的细胞挽救出来了。

用加了25μg/ml两性霉素B的洗涤液洗了三遍。

再转移到新培养瓶里，加高浓度抗真菌药维持两天。

最后竟然救回了不到20%的细胞，足够重新扩增。

不过老张也提醒，如果是支原体污染，肉眼根本看不出。

他后来养成了每个月用PCR检测一次支原体的习惯。

每次提取兔原代细胞前，所有试剂都要做无菌验证。

操作台里的紫外灯提前开够40分钟，新风系统保持正压。

这些看似繁琐的步骤，其实能省下后面大量的补救时间。

老张现在做兔原代细胞已经很顺手了。

上个月他分离了兔肝细胞，一次成功，活细胞率91%。

他说最大的收获不是学会了一门技术，而是明白了细节决定成败。

从组织进行取材开始，到实施消化过滤为止，从配置培养基的比例，到把握换液的时机，每一个步骤都不能着急。

如果你也在做兔原代细胞，不妨对照着检查一下自己的流程。

也许调整一两个参数，结果就会完全不同。