前两天，我的那位从事生物技术研发工作的老朋友阿杰，从上海虹桥打来了一通电话，其语气之中，流露着一种劫后余生般的庆幸之情，他讲道，最近终于成功地将项目推进到了预实验的阶段，并且，在此之前，足足有三个月的时间，他以及团队，险些被一个表面望去并不起眼的小问题给拖垮！
阿杰在上海浦东的一家生物科技公司工作，负责免疫分析平台的搭建，去年年底，他们承接了一个项目，项目内容是对环境样本中的痕量污染物进行检测，按照流程，第一步要做的是选择合适的ELISA试剂盒，当时他认为这事容易，市面上数量众多的牌子很多，随便挑选一个口碑突出的不算是难事，结果，正是这个随意的行为，让他遭遇了一个严重的问题。
ELISA试剂盒怎么选
阿杰头一回进行采购之际，为图省事挑选了某个价钱较为便宜的国产盒子 ，今年1月初 ，他于张江高科园区的实验室里依据说明书展开操作 ，预实验的标准曲线相关系数好不容易才达到0.98 ，他心里觉得还算可以 ，然而等到正式去测同一个批次的加标样本之时，问题显现出来了 ，板内变异系数超出了15% ，重复孔之间的吸光度值好似过山车那般忽高忽低。
他着手去排查致使结果糟糕的原因，其中移液器已经校准过，洗板机运行状态亦是正常，孵育温度借助恒温箱被精准控制在37度。他为此折腾了整整一周时日，期间更换了三批日期各异的样本，然而最终结果仍旧不尽人意。随后他拨通电话向厂家技术支撑进行询问，得到的回应却是支支吾吾，直至最后对方才坦承那批试剂盒的包被抗体在批次之间的稳定性未能得到有效控制。
阿杰此刻才弄清楚，挑选ELISA试剂盒时不能够仅仅依据价格以及品牌宣传来抉择。他梳理出了一条心得，必须去向厂家索要每一个批次的质控报告，着重查看“板内变异系数”及“板间变异系数”这两项参数，依照原则来说分别要低于10%以及15%。此外，不要嫌麻烦，先购买小包装去做预实验进行验证，不要一开始就大批量地采购。
标准品浓度不准怎么办
换了另外一家供应商所提供的产品之后，阿杰再度遭遇了全新的麻烦。在今年2月中旬这个时间段，他对某个加标浓度设定为50pg/mL的样本展开检测，检测出来的值始终呈现偏低的状况，仅仅只有30左右。他把标准曲线反复做了三次，复孔之间的精密度展现得相当良好，然而计算出来的样本值却偏偏是不正确的。
他将试剂盒当中自带的质控品当作样本跑了一回，发觉质控品的回收率仅仅只有72%，远远低于说明书所宣称的85%至115%。阿杰察觉到，问题出在了标准品上面。他拆开另外两盒同批号尚未拆封的试剂盒，分别对标准品进行复溶后重新标定，发现不同盒子里的标准品活性竟然相差了20%。
那时他气得相当厉害，然而项目不能够停止运行 ，他迅速地联系了厂家 ，对方给出的建议是他去使用外购的独立标准品用于校准进行操作 ，阿杰拜托朋友从杭州那个地方借来了一管经过国家参考物质标定的标准品 ，回来以后重新去做标曲方面的工作 ，然后再去测量原来的加标样本 ，回收率最后终于拉回到了90%左右。
这件事使得他记住了一项铁律，那就是，于做准确限定数量时，不要全然迷信试剂盒自身所带的标准品，特别是特别情况之下，最好另外购置一套具备证书的标准物质用作对照，经由双标曲验证方可安心。
样本基质干扰怎么消除
起初以为问题就到这儿了，没料到三月份的时候又出现了个更为隐蔽的坑。阿杰手中所拥有的实际样本是土壤浸提液以及地表水样，其成分是复杂的。他直接拿着未经处理的样本去进行检测，结果发现加标回收率仅仅只有大概50%，并且随着稀释倍数的不断增加，检测值呈现出不成比例地下降态势——这属于典型的基质抑制效应。
他着手去查文献，还询问了中科院位于南京的某位师兄，这位师兄给出建议，让他做“基质匹配标准曲线”，阿杰依照此建议去做：选取同批次不含有待测物的空白基质，采用基质对标准品进行逐级稀释，并非使用说明书里提及的缓冲液，与此同时，他将所有样本都实施了两倍、五倍、十倍的稀释操作，以此观察稀释线性。
有意思的是结果，两倍稀释后算出的浓度值和原液较为接近，然而五倍以上便严重偏离，这表明样本里存在高浓度的干扰物，阿杰最终确定了一个折中方案，所有样本统一进行两倍稀释，而且每个样本都做基质加标回收，如此一来，虽说多费了半天时间，但是数据的真实性与可靠性大幅提高了。
显色结果不稳定如何排查
四月上旬，阿杰所在的团队最终获取了首批看来较为可靠的数据。只是在打算正式开展大样本研究的前一日，实验室里的恒温孵育箱出现故障，临时替换成了一台旧的震荡水浴锅。次日进行显色操作时，所有孔呈现出的颜色相较于先前显著变浅好多，标曲的OD值在整体状况下下降了一个等级。
阿杰赶忙进行排查，察觉到水浴锅的温度分布并非均匀，靠近加热管之处温度高出了2度，边缘位置又低了1.5度。在ELISA反应里，酶催化的显色步骤对于温度极为敏感，相差一两度便会致使反应速率产生变化。他即刻叫停实验，借用了隔壁实验室的孵育箱重新开展，并且严格作出规定：所有孵育步骤必定要使用同一台校准过的恒温设备，水温或者气温的波动不超过0.5度。
同一时间，他留意到显色时间也务必精准。说明书标明“室温避光显色十五分钟”，然而上海四月份处于室温状态时上午与下午温差可达四五度。他将显色方式改为在恒温箱内进行，并且每一块板子自加入底物液起始便借助计时器开始倒计时，时间一到马上添加终止液，严格把控在正负三十秒范围之内。实施这些调整之后，批间重复性由原来的百分之二十降低至百分之八以内。
数据超出量程怎么处理
阿杰在上周，对全部预实验数据进行了分析，发现有十几个高浓度样本的OD值，已然超过了标准曲线最高点的吸光度。基于常规做法，这属于“超出定量上限”，若直接报告“大于最高标曲点”，是不专业的行为。他查阅了试剂盒的线性范围，说明书标称的是15.6 - 1000pg/mL，然而他算出的样本最高值有1800多。
阿杰做出了一项决定，要将所有超标样本再次进行稀释，使用样本稀释液制作两倍、五倍、十倍这三个梯度，每个梯度都要做双孔，接着从各梯度双孔中，挑选出落在标准曲线中段（也就是最好处于50% - 70%之间的浓度点）的那个稀释倍数来进行换算。他还专门对稀释后的样本，是否处在曲线范围内、回收率是否合格进行了验证。
而且，他察觉到存在少量样本的OD值，甚至要比空白孔的数值还要低不少。这属于典型的“钩状效应”，鉴于样本里待测物的浓度过高，从而反倒抑制了抗原抗体的结合情况。解决的办法是增大稀释倍数之后再去进行测量检测。阿杰将这类样本重新做了五十倍的稀释，果真得到了合乎情理的数值。
遭受三个多月的磕磕碰碰状况，阿杰起初对ELISA试剂盒持有半信半疑的态度，直至如今能够在闭眼的状态下讲出十几个存在问题可能性的环节。他近期于朋友圈发布了一条动态，内容为：“倘若你检测出来的数据极为漂亮，反倒需要谨慎留意了。”他宣称，真正意义上的实验高手并非一次便达成成功，而是明晰每一步骤有可能出现失误的地方，并且预先将安全保障措施做好。
此时此刻，阿杰所在团队的项目最终顺遂通过了中期评审。他已将这段日子里全部的踩坑记录整理成了一份内部培训手册，刚入职的新同事在首次进行ELISA操作前，定然得先读完这份堪称“血泪史”的资料。阿杰讲道，倘若让他回归到三个月以前的时光，他必定会对那时的自己这般说道：切勿嫌验证试剂盒的流程繁琐，切勿跳过基质匹配这一环节，切勿忽视每一个温度里那零点几度的细微差别。这些看似微不足道的细节之处，最终都会呈现在你的数据之中。
