一、从一次失败的扩增说起

上个月中旬的时候，我前去拜访了一位老朋友，这位老朋友是老李，他在一家生物技术公司工作，在这家公司里他负责分子检测产品的研发。

说到最近所开展的工作，老李不禁发出一声叹息，表明在三月初时那一批样品的PCR扩增之后所得到的结果，全都成为了无效的状态，最终被判定作废了。

那时候，我略微感到有些意外，老李于这一行业历经摸爬滚打长达七八年之久，其手上所具备的功夫向来十分稳健，为何竟会出现这般批量的失误呢？

他摇摇头，说问题不在操作上，而是试剂出了状况。

那一周之内，他接连做了三次重复的实验，目标条带，要么呈现出非常微弱的状况，要么出现了并非特异性的扩增现象，并且，还有几个孔，完全没有任何信号。

客户送来的样品，已然存放了一阵子，团队的成员，心急得团团直转，毕竟反复冻融，会对核酸完整性造成影响，再这么拖延下去，就连补救的机会，都不会有了。

李氏后来耗费两天光阴，自引物之设计起，自模板质量至退火温度，逐一展开排查。

最后他把矛头指向了PCR反应试剂盒。

二、PCR反应试剂盒的核心指标，很多实验室容易忽略

老李跟我讲，他们先前始终使用某一品牌的常规试剂盒，它的价格并非高昂，运用了将近两年时间也未曾出现过较为严重的问题。

然而，这一回的状况致使他察觉到，PCR反应试剂盒相互之间的差别远比他所设想的还要大得多。

他向我列举了好些例子，像酶的热启动修饰工艺，要是操作欠佳，于低温环境下便会出现非特异性延伸情况；又像缓冲液内的镁离子浓度，不同试剂盒的配比间相距甚远，这会对扩增效率以及特异性造成直接影响。

还有一项关键指标是试剂盒对抑制剂和杂质的耐受能力。

些许样品就算历经纯化处理，依旧留存少量蛋白质、多糖或者酚类物质，普通PCR反应试剂盒于这些状况下扩增效率会显著降低。

老李讲了这么个情况，此次出现问题的那件样品，恰好是源自一种相对而言较为特别的基质，普通的试剂盒没办法应对！

之后，他去查阅试剂盒说明，发觉那批次产品批间差额把控并不稳定，有一项关键酶活性单位标注范畴过于宽泛。

也就是说，同一盒里的不同批次，实际性能可能差出一截。

三、换一种PCR反应试剂盒，结果完全不同

四月初，老李决定换一款PCR反应试剂盒试试。

他并未盲目去追求进口大牌，反而是率先梳理出了自身的真实需求，那需求是，样品类型较为特殊，这就需要具备高抑制剂耐受性，目标片段的GC含量偏高，故需要拥有更强的解链能力，实验频率很高，所以需要批间稳定性良好，最好还能够在室温存放一段时间。

按照这几个条件，他筛选了三款PCR反应试剂盒做对比测试。

4月7日至4月9日期间，进行测试动作的地点，位于他们公司的实验区，在此期间连续完成了三块96孔板的操作。

他把原来的试剂盒用作第一块板的对照，其结果和之前并无二致，条带呈现弥散状态，背景噪音存在偏高情形。

换了一款试剂盒，是第二块板所使用的，这款试剂盒宣称具有高灵敏度，灵敏度确实提升了，然而非特异性扩增也有所增加，有几个引物二聚体跑得极为明显。

第三块板所采用的，是另外一款专为应对复杂模板而设计的PCR反应试剂盒，其结果，使其眼前顿然一亮。

有一个清晰锐利的目标条带，背景是干净的，并且同一个样品于不同孔位之间的Ct值差异是非常小的。

老李说那一瞬间，整个实验室的人都松了一口气。

四、选择PCR反应试剂盒的三个实操经验

那件事情过后，老李归纳出了几款经验，我认为这些经验对于进行分子实验的友人具备颇高的可供参考的价值。

第一个经验：不要只看品牌，要看匹配度

不同PCR反应试剂盒的设计侧重点不同。

当中有的朝着高保真度的方向倾斜，这种适合用于克隆以及测序；当中有的朝着快速扩增的方向倾斜，这种适合开展大规模筛选；当中有的朝着高抑制剂耐受的方向倾斜，这种适合处理复杂样品。

老李讲，早些时候他一直认为贵的便是好的，现如今他知晓了，寻觅到与自身样品体系适配的那个款式，相较于一味地追逐进口品牌而言更具性价比。

第二个经验：同一样品，用多个试剂盒做横向对比

老李这次能快速找到问题，一个关键动作就是做了对比测试。

他采用了经由同一次配好而成的混合体系，用的是同一批模板以及引物，仅仅是将PCR反应试剂盒予以更换，其余所有条件全都维持一致。

这样对比出来的结果才公平。

他提议实验室于引入新试剂盒之际，至少选取三款同类产品去展开平行比较，切莫仅着眼于单次实验的数据，而是要进行两到三个批次的重复。

第三个经验：注意保存和使用中的细节

老李说，有些试剂盒性能不稳定，其实跟使用习惯有关。

像那种反应预混液要是反复进行冻融操作，那么酶活就会显著地下降。又比如在加样之时，当没有充分实现混匀这个动作，或者未曾进行短暂的离心处理，如此这般都会对孔间一致性造成影响。

他目前所采取的做法是，在收到新一批次的PCR反应试剂盒之后，首先要进行分装，将其分成小份，接着要注明日期以及批号，随后每次仅仅取用所需要的量。

除此之外，他会于正式实验之前，去跑一个规模较小的梯度板，以此来验证最佳退火温度，而这一点常常会被忽视，然而实际上却是极为关键的。

五、从一次故障到一套标准流程

老李他们公司现在建立了一套新的试剂验收流程。

每一批新抵达的PCR反应试剂盒，都必然要先开展三项基础测试，一项是灵敏度的梯度稀释测试，一项是特异性的无模板对照，还有一项是重复性的孔间变异系数计算。

只有这三项都通过，才能用于正式样品。

老李说这套流程看起来增加了工作量，但实际上是节省了时间。

假设要是如同先前那般，一直到实验失败之际才发觉原来是试剂存在问题，那么所损耗的可不单单是试剂以及样品的成本，就连整个项目的周期以及团队的士气，同样也是会有所亏损的。

最迟在上个月底的时候，老李运用才新被定下来的PCR反应试剂盒另行去重新跑了那一批本来就产生问题的样品，最终所有的数据全都一次性顺利通过，客户方面表现出了极度的满足感。

他还把这次的经验写成了内部培训材料，分享给同部门的同事。

六、写在最后

老李的这段经历让我感触很深。

许多情形下，实验未能成功做出，众人的首要反应乃是怀疑自身的操作，或者怀疑引物的设计，鲜少有人士会去置疑试剂盒自身。

然而，实际上，聚合酶链式反应试剂盒的质量出现波动，展现设计偏向，存在批次差异，这些都极有可能成为致使实验告负的关键因素。

要是读者朋友近来也碰到了扩增效率低下，且非特异性条带众多，还有灵敏度不足等诸般问题，倒不妨如同老李那般，耗费点时间去做一回试剂盒的横向比较。

挑选一个同自身样品体系相匹配的PCR反应试剂盒，接着配合规范的操作流程，好多旧有的毛病或许就会迎刃而解了。

指望老李那实实在在发生过的经历能够给众人某些有所启迪的东西。要是你同样存有类似的经历，乐意在脑海之中记下一笔，下次碰见问题之时翻出来瞧瞧，说不定就能够少走一些冤枉的路。