有一位叫老陈的朋友，我认识他，他从事食品成分分析工作，于第三方检测机构工作了六年。
去年，他承接了一个项目，项目内容是对植物提取物抗氧化活性进行评估，原本觉得轻而易举，可不料前前后后反复折腾，耗费了将近半年时间。
不是样品处理出现了问题，也不是仪器操作存在不熟练的情况，而是卡在了一个最为基础的环节，这个环节是生化试剂盒的选择以及使用上。
后来，老陈跟我复盘，讲那段日子简直如同在迷宫里来回打转，明明是依照说明书一步步来做的，然而出来的数据，要么是飘忽不定，要么是平行样本之间差异大得超乎想象。
今日，我会将属于他的那段经历撰写出来，渴望能够对正饱受生化试剂盒困扰的友人予以助力。
生化试剂盒重复性差的原因
那个名为老陈的人的项目，起始时间是去年九月，其项目开展地点，位于苏州工业园区内的一家共享性质的实验室。
他存在检测一批植物提取液总抗氧化能力的需求，挑选了一款于市面上较为常见出现且基于铁离子还原法的生化试剂盒。
做预实验是首次，针对六个重复孔所测的吸光度值，其变异系数超出了百分之十五。
那次，老陈觉得是自己加样时手法不够熟练，于是又小心翼翼地重新做了一回，然而最终得到的变异系数竟然依旧是百分之十二。
他着手开展排查缘由的工作，具体涵盖：试剂是不是新近进行配制的，孵育时的温度是不是保持稳定的，酶标仪有没有完成校准操作。
在这些均被确认不存在差错之后，老陈拨打了电话给试剂盒厂家的技术支撑人员。与之相对的另一方询问他，样本是否开展了脱蛋白处理这一操作。
老陈出现了一愣的情况，说明书上面仅仅写着“样本需澄清”，他并没有朝着脱蛋白那一个步骤去进行思考。
嗣后，他凭着三氯乙酸沉淀法对样本予以处理，而后又进行测量，最终变异系数降至百分之八以内这项事实是成立的。
老陈因这件事明白了这样一个道理，生化试剂盒重复性差，在许多时候并非试剂盒自身的问题，而是样本基质对反应体系产生了干扰。
植物提取液之中存有大量的多酚，还有蛋白质以及色素，这些物质会径直跟显色剂产生非特异性反应。
因此，后来老陈形成了一种习惯，在拿到任何生化试剂盒之时，首先仔细查看说明书里的“样本前处理”部分情况，查看其中是否存在针对特殊基质的补充说明。
倘若不存在，他便会主动去查与之相关的文献，瞧瞧别人所用同类样本之际究竟是怎样予以处理的。
生化试剂盒如何选型号
老陈在这个项目上踩的第二个坑，是关于选型。
从起始阶段他所运用的那个试剂盒，其检测范畴在于每毫升零点一至十毫摩尔当量。
其样本预估浓度处于两毫摩尔大概之水准，按道理来说处于检测区域内，本应是无问题的。
但在实际进行测量得出结果时，高浓度的样本所呈现的信号值直接达到了饱和状态，而低浓度的样本其信号值却又十分贴近检出限。
老陈始终想不明白，随后通过采用稀释梯度来开展了一轮预实验，这才发觉样本相互之间浓度存在着极大的差异，浓度最高的那个样本经过稀释二十倍之后才下降到线性区间的中部位置。
那位提供技术支撑的人跟他讲了，在挑选生化试剂盒型号之际，不能够仅仅去看检测范围所具有的上限，还得留意线性范围实际呈现出的宽度。
有些试剂盒所标称的范围无比宽泛，然而，其真正具备线性的部分，或许仅仅是中间的两三个数量级。
有着老陈之称的人，于后续阶段学习到了一项技能，在正式开展实验以前，先行选取两三个具备代表性的样本，实施一倍、两倍、四倍、八倍以及十六倍的梯度稀释操作，接着再分别进行测定。
针对所测得的值，将其针对稀释倍数来开展回归操作，去查看是否为经过原点的一条直线状。要是并非如此，那就表明样本当中存有着基质效应，又或者试剂盒的线性范围没办法充分覆盖浓度变化。
鉴于这个经验，老陈于以后采购生化试剂盒之际，都会向供应商索取真实的批次质检报告，尤为关注线性相关系数与检测限这两个参数啦。
他另外加了一个跟行业相关的交流群，是在这个群里头，有人曾分享过一份对比表格哪，这份表格可是罗列清楚了不同品牌、同一类型的试剂盒，于实际样本当中所呈现出来的表现情况那种，这样子的做法相较于他只是一味盲目地去看说明书而言，那是要可靠得多的呀。
生化试剂盒质控怎么做
去年十一月，老陈所负责的项目步入了正式的检测时期，呈现出的数据看上去还算良好，然而他的内心自始至终都未曾感觉到踏实。
因为他没有设置任何质控样本，只做了空白对照和标准曲线。
那位曾教导过他的导师表示，对于一个称得上优质的生化试剂盒进行相关实验时，是必然需要涵盖三套质控内容的，这三套质控分别是试剂空白，样本空白以及质控品。
以不加样本、仅添加缓冲液与显色剂制成的试剂空白，其用途在于监测试剂的本底有无出人意料的不正常情况。
样本空白乃是样本添加缓冲液却不添加显色剂里的关键底物，其作用是用以扣除样本自身颜色所带来的干扰。
存在这样一种物质，它是已知浓度的标准物质，叫做质控品，它要和样本进行平行测定，，其目的在于验证整个操作流程是不是处于受控状态。
起先，老陈曾有过偷懒行为，所做之事仅为试剂空白而已。而后，他耗费一百多块钱购得一支具备证书的标准物质。随后，他将其与样本一同进行了一次操作流程。
结果发觉，质控品的测定数值，相较于标称数值，低了百分之九，此情形超出了允许偏差的范围。
他赶忙进行排查，发觉原来是孵育的时间相较于说明书所要求的少了三分钟，缘由在于那天他同时开展三个各异的生化试剂盒实验，时间没能精准卡住。
这个发觉致使老陈惊出一身冷汗，倘若他并没有操作质控品，那前面整整一周所测量的几十个样本都会全部被判定无效，并且还必须得再次进行采样。
从此往后，老陈于每一个检测批次当中，都会放进低、中、高这三个浓度的质控品，接着绘制质控图。
他专门去买了一个多通道定时器，针对每个试剂盒，其每一步反应时间都进行单独的倒计时操作，如此一来便不再依靠手机闹钟了。
数据异常时的排查思路
老陈曾讲过一句极具价值的话，是，使用生化试剂盒出现问题并非可怕之事，可怕之处在于不清楚该从什么地方着手去进行查找。
他总结了一套排查顺序，我听了觉得特别实用。
瞅一瞅颜色的变化情况，要是空白孔呈现出的颜色相较于样本孔而言更深，那么很大概率应是试剂受到了污染，抑或是在孵育的过程中遭受到了光降解的影响。
观察标准曲线的决定系数，要是其低于零点九九，那就表明标准品稀释环节出现了问题，又或者是加样枪不准确。
查看平行样本的变异系数，若其超过百分之十，那么首先应优先怀疑加样操作存在问题，其次才是怀疑样本不均一。
查验质控品的回收率，要是并非处于百分之八十五至百分之一百一十五这个范围之内，那就得思索样本基质带来的干扰或者试剂已然失效的情况。
曾经有一回，老陈碰到这般状况，标准曲线相当不错，然而样本重复性却极其糟糕，就顺着这个思路，他查找了三天时间。
最终发觉是样本于冻融进程当中形成了絮状沉淀，离心之后上清液看似澄清，实则颗粒物在微孔里沉降，致使每个孔的固体含量存在差异，有不一样的情况。
他用滤膜过滤了样本后重新测定，重复性马上好了起来。
这件事使我察觉到，生化试剂盒实验的成功或失败，情况往往并非取决于试剂盒自身，而是要看实验者对于样本物理化学性质的知晓程度处于何种状况。
值得记住的三条经验
老陈如今已然成为他们实验室里运用生化试剂盒的操作能手嘞，新入职的同事碰到问题都会去寻他。
他把自己这半年走过的弯路总结成了三条铁律，我觉得特别实在。
第一条千万别迷信说明书，说明书所写乃普遍情形，而你的样本始终存有自身的特殊性，要先开展稀释梯度以及加标回收实验，待确认不存在基质干扰之后再正式进行上样。
第二条质控品并非成本，而是一种保险，一瓶质控品或许要几百块钱，然而它能够助力你规避几千块乃至几万块的重复性劳动。
第三条设立属于自身的操作核查表。对于生化试剂盒的流程而言，常常存在着七八道步骤，每一步骤所对应的时间以及温度，只要稍微出现偏差，最终的结果那可是有着极大差异的。要将核查表给打印出来，在进行每一步操作时就打一个勾，这样相比仅仅依靠脑子去记忆可要可靠许多。
去年年末，老陈成功让那个有关植物提取物的项目完成结题，在数据发布出去以后，客户表现出了极为满意的状态，基于这种满意，又为他引荐了两个全新的项目。
每次，在他开启生化试剂盒之前，他都会花费十五分钟，将样本前处理方案书写于实验记录本之上，随后才着手去做。
用他自己的话说，磨刀不误砍柴工，前面慢一点，后面反而快。
写到如此地步的这篇文章，期望能够给予你某些启示。要是你的实验也曾碰到过相似状况，无妨尝试一下老陈的这些办法。
