在去年的那个秋天，一个契机使我结识了一位朋友，这位朋友在生物技术公司从事产品研发工作，他姓周，大家都唤他老周。他曾于一家中型企业任职长达六年之久，其主要负责的工作内容乃是分子检测方法的优化事宜。老周此人，技术方面的根基极为扎实。但其存在着一个问题，即太过坚信“贵的就是好的”这一观点。每当进行实时荧光定量PCR这项操作时，他始终坚决保持持选用最为昂贵的试剂盒以及采用最为复杂的流程这种做法，自认为唯有如此才能够确保所获取的数据不会受到他人的质疑。
但在去年十月份的时候，发生了一件事，这件事彻底改变了他的想法。那时，他们公司接了一个来自大客户的订单，该订单要求在两周内完成2000份样本的病原微生物定量检测。由于时间紧迫，任务繁重，老周依照老习惯，直接使用了某个进口品牌的高端试剂。然而，第一轮检测跑下来，成本直接超出了标准40%。老板找他谈话，所说的话语里话外就表达了一个意思：再按照这样的方式干下去，项目就会亏钱。
实时荧光定量PCR的试剂选择真的有门道吗？
那几天，老周愁得晚上根本没法入睡，他私下里同一个人吐槽，说他在那里干了六年，从来就没有任何人告诉他，试剂居然能够按照场景来选择，他一直以来都觉得越是昂贵就越好，越是通用就越安全。
他后来被逼迫着去开展对各个品牌的实时荧光定量PCR试剂的研究工作 ，他耗费了整整三天的时间 ，将市面上诸多主流品牌以及国产平替试剂的说明书逐一翻阅了个遍 ，还寻觅了几位在检测机构就职的老同学去打探实际所产生的使用体验。最终他察觉到 ，许多被吹嘘得神乎其神的 “高灵敏” 试剂 ，在常规定量这类场景当中 ，与普通试剂所呈现出来的数据根本相差不多。
区别的关键所在是引物探针的匹配程度以及扩增效率，并非价格铭牌。举例来讲，有的试剂对于GC含量偏高的模板格外友善，有的试剂却是对低拷贝数的样本更为敏感。老周以往从来都不关注这些的，如今他把每一个样本的模板特性都列举出来，接着选取对应场景的试剂，成本径直砍掉了一半。
如何设置最优的实时荧光定量PCR反应体系？
光进行试剂更换是远远不够的，老周察觉到他所身处的反应体系存在着极为严重的问题。他往昔开展实时荧光定量PCR操作时，一贯都有着将模板添加至上限的习惯，内心认为模板加多了必然信号就会很强。然而这般做法极易致使酶的反应体系被撑破，进而引发非特异性扩增的情况出现。
今年一月上旬，他开展了一回对比试验。至于同一批次的样本 ，当初照着老办法添加了5微升的模板 ，然而结果是Ct值于28至32区间内无序蹦跳着 ，且重复性表现糟糕透顶。过后呢，在按照优化好的方案的状况下 ，先将模板量减低至2微升 ，与此同时还把引物浓度由0.4微摩尔每升改动为0.3 微摩尔每餐呐 ，镁离子浓度方面 同样做出了细微的调整。可结果简直让人惊掉下巴：Ct值稳稳当当定格在了30.2至30.5区间内 ，三个复孔的CV值从先前的15%降低到了3%以下，很是惊人！
老周跟我讲，他原以为体系越满越棒，实则每个成分都存在自身最佳浓度区间，一旦超出此区间，系统就不稳定了。之后他把这事写成内部培训材料，标题称作《实时荧光定量PCR反应体系优化的三个黄金法则》，如今他们整个研发部门都在运用这套标准。
扩增曲线异常到底该怎么排查？
二月中旬的时候，老周再度碰到了新的状况，有一批样本的扩增曲线老是呈现出双峰的情形，并且平台期的信号一会儿高一会儿低，他起初怀疑是受到了污染，于是把整个操作台进行了两遍消毒处理，更换了新的枪头，再度配置了体系，然而问题依旧存在。
他在之后跟我就这件事进行复盘讲述时讲道，他差一点就将这二百个样本全部弄成报废状态了。还好他在一个行业论坛之上看到了一个帖子，其内容讲的是实时荧光定量PCR里面的引物二聚体相关问题。接着他回到回去之后把引物重新进行了一遍设计，使引物序列得到了加长，并且提高了退火温度，而且还做了梯度PCR用以确定最佳的退火温度。
跑完以后再改，扩增曲线清清爽爽，单峰、陡峭、且平台期呈平直状。老周舒了一口气，讲：“有时问题并非在于操作自身，而是在实验设计的最起始之处。引物设计欠佳，后续的全部努力都将付诸东流。”。
如何利用内参基因提高实时荧光定量PCR的可靠性？
四月份之际，老周承接了一项更为复杂的任务，具体内容为进行多个组织样本的基因表达差异分析。此次样本的来源丰富多样，存在经过冻存的，有新鲜提取所得的，另外还有经过甲醛固定处理的。倘若运用同一个内参基因去实施归一化的操作，那么最终的结果必定是不准确的。
这下老周可学机灵了，他先是针对每一个样本开展了RNA质量评估的工作，随后挑选出三个候选的内参基因去进行稳定性测试，他察觉到，在部分样本当中，GAPDH的表达量出现了极大的变化，不过beta-actin却呈现出很稳定的态势，等到换成另外一批样本时，状况却完全颠倒过来了，最终他综合运用了两个内参基因并求得几何平均值，才精细地把数据归一化妥当。
他跟我讲，以往他认为内参乃是固定搭配，如今才晓得，各异的样本适配的内参全然不一样。不开展预实验就生硬套用公式，得出的数据压根不可信。
实时荧光定量PCR的数据分析该用哪种方法？
当数据跑出来以后，老周又遭遇到一个抉择：是采用绝对定量呢，还是运用相对定量呢？他先前对于这个问题的领会始终是模模糊糊的，认为不管怎样都是在计算拷贝数，差异并不是很大。
这下，他针对两种方法的原理开展了认真的研究。绝对定量这一方式，是需要去构建标准曲线的，并且对于扩增效率的要求是极高的那种状态，同时，标准品的稳定性可是会直接对结果产生影响的，其关联程度不容小觑。而相对定量呢，借助内参归一化这种手段来达成评估，它更多地是去关注基因表达的变化倍数情况，在绝对拷贝数方面的要求并不高，也就是没那么严格的那种程度。
他最终做出决定，针对客户所要求的病原微生物拷贝数，运用绝对定量加标准曲线方式来处置；对于用于内部研究的基因表达分析，则采用相对定量法，借助2的负delta delta Ct公式。这两种方法各尽其责，其各自的数据质量以及合理性都有了显著提升，上升到了一个新的层面。
如何避免实时荧光定量PCR中的常见操作失误？
五月初时，老周针对所有这般经验实施了一回系统复盘，经整理后形成了他们实验室的SOP。他着重突出了操作细节具备的重要性：加样之际，枪过头需紧挨着管壁插入，以此规避产生气泡；封膜时候要压实，用于防止因蒸发致使体系体积出现变化；上机以前务必开展短暂离心，将管壁上的液体甩至底部。
他特意提出，每次进行实时荧光定量PCR时，都要设置无模板对照，还要设置无逆转录对照，这是用于判断是否存在污染以及有无基因组DNA残留的唯一方法。之前他认为这些对照是对试剂的浪费，如今他明白，没有对照所产生的数据，基本上就是没有实际效用的数据。
他们公司的技术骨干是老周，现在每个月老周都要给新员工做培训。老周常跟新人说这样一句话：“实时荧光定量PCR不是一个能凑合的技术，每一个环节都要较真。从被老板骂到之后被老板夸，将我二者分隔开来的，中间差的不是运气，是对细节怀揣的敬畏之情。”。
要是你恰好置身于同实时荧光定量PCR存在关联的情境之中，倘若有可能的话，不妨自当下这一日起始，去查验一番你所选用的试剂，审视一下反应体系，核查引物设计状况，进而评判数据分析途径到底如何。唯有成本能够实现降低，数据趋向精准无误，如此这般才称得上是具备久经时日方可显现的那种价值的体现。
