去年秋季时节, 我于杭州滨江的一家从事生物科技的公司担任研发主管职务, 当时手头正在赶一个关于基因表达量的项目, 那个时候团队每日都加班, 目的仅仅是为了将某条信号通路的检测精度提升上去, 然而却偏偏在一个环节上遭遇了阻碍, 此环节便是PCR定量试剂盒的稳定性方面。
我存在一位被称作老张的朋友, 其岁数比我大两岁, 于苏州的一家第三方医学检验所工作了六年, 在相关圈子里是颇有名气的“PCR老炮”。他平常话语数量不多, 然而一旦聊到实验方面的细节, 便能够跟你持续掰扯长达两个小时。他在去年十一月承接了一个规模较大的单子, 此次单子具体是要为某三甲医院的外包项目开展一批呼吸道病原体定量检测工作。该单子规模不小, 样本的数量接近三千份, 并且时间方面所施加的压力较为紧迫, 即便如此老张还是拍着胸脯承接了。
可刚开工就出了幺蛾子。
一直以来, 他们实验室选用的是某进口品牌的PCR定量试剂盒, 其价格不菲, 然而好在具备稳定性。可是, 那批货物因物流方面出现问题, 被滞留在海关, 迟迟无法到达。由于医院方面催促极为急切, 老张只好临时从国内寻觅替代品。他挑选了三个国产品牌, 率先利用自己的质控样本展开测试。
首轮测试时查出问题, 存在某品牌试剂盒于低拷贝数样本当中, Ct值波动极为显著, 复孔之间相差可达1.5个循环, 老张告知我, 如此稳定性, 若应用于临床样本, 简直是自掘陷阱。另一品牌虽稳定, 然而扩增效率极低, 历经四十个循环后, 荧光信号恰似平底直线, 压根无法实施定量。
那时, 他着急得嘴上冒出了泡, 跑到我的办公室, 蹭了一杯咖啡, 接着叹气说道, “我这一生从未如此这般求过人, 当下必须得祈祷试剂盒能够争气些。”。
我向他推荐了一款产品, 是我先前合作过的国内一家厂商所生产的, 名为“艾科”的PCR定量试剂盒, 老张对此半信半疑, 不过是死马当作活马医, 还是拿回去进行了一轮测试。待结果出来之后, 他在凌晨一点给我打电话, 其语气是那种抑制不住的兴奋, 言道: “兄弟, 你此次的推荐很靠谱！我对三批样本进行了测试, 每一批均有十六个复孔, 其Ct值标准差仅仅才0.2, 线性范围可以覆盖六个数量极为丰富的等级, 就算是低拷贝的情况也能够稳稳地保持住。”。
随后, 老张正式借助那款试剂盒完成了全部样本的检测, 按时将项目交付。医院方面的质控反馈已然得出——针对所有样本定量结果同金标准的测序数据展开比对, 相关度R²高达0.997。老张其后在行业群里发布了一条消息: “国货如今着实并不差, 关键在于你要选准。”。
我问他，那你是怎么选对的？老张掰着手指头讲了几条。
PCR定量试剂盒怎么选才靠谱？
老张讲, 第一步便是要看线性范围, 他跟我讲, 好多试剂盒宣称能够测十个数量级, 然而实际弄下来, 高拷贝端或者低拷贝端总会有一个不行, 他此次选的试剂盒, 厂家给出的线性范围是10¹到10⁷拷贝数, 他实际检测下来, 10²拷贝数以下也能够维持稳定, 这点在低丰度靶标检测当中尤为关键, 比如肿瘤液体活检, 样本里突变基因可能就几十个拷贝, 试剂盒要是测不准确, 那结果就是没用的。
扩增效率不能忽视
老张对扩增效率予以了强调, 他讲, 在理想情形之下, PCR扩增效率应当处于90%至110%的范围之中。倘若效率变低, 那么定量结果将会偏低；要是效率变高, 就有可能出现非特异性扩增。他之前所测的第二个品牌, 其效率仅仅只有75%, 根本无法使用。而他最终选定的那一款, 效率稳定在98%左右, 并且批间差也小。
稳定性才是硬道理
老张专门提及, 他搞试剂盒评估时段, 专门安排执行了绵延四天时日且从未中断间歇时间的测试进程, 每一天都运用同一批次的试剂盒去检测同样的样本。最终所获取的Ct值出现变易, 其变动幅度是小于0.3个循环整数值的。这样的一组数据使得他内心安定得以放心——针对实验室日常开展的检测工作而言, 样本乃是陆陆续续地进来的, 假使用到的试剂盒在批次之间缺乏具备稳定特性的状况, 那么所产生的结果便不能够进行横向上的比较。
售后服务别忽略
最后老张还讲了一句, 声称国内有一些厂商的售后是极为到位的, 他当时拿到试剂盒之后, 有一个技术参数不太明确, 在凌晨的时候发微信给厂家的技术支撑, 结果人家十分钟就回了电话, 还耐心解释了好半天, 这种响应速度, 进口品牌基本上是别想达到的。
有着“野生代言人”之称的老张, 如今代言的是产自国内的试剂盒。于上周, 他给我们发了消息, 告知自家实验室发生全面换代这件事情, 并表明成本降低了近乎一半, 然而数据质量却变得更好。他以开玩笑的方式表达: “要是早晓得是这样, 那以往花的冤枉钱则相当没必要。”。
倘若你同样正在开展定量PCR关联的实验, 不管是基因表达剖析、病原体检测亦或是拷贝数变异分析法, 试剂盒的稳定性直直白白就决断了你的结果可不可以被运用。切莫仅仅去观看宣传参数, 切实去跑上一批样本, 测量几个关键指标, 这比任何事情都要可靠。
