我的朋友老赵，一个被“检测”折磨了三年的实验员
我在生物行业认识了快十年的朋友是老赵, 他在一家第三方医学检验所负责分子检测平台的日常运营。三年前, 他刚接手这个岗位, 当时算得上是意气风发, 他觉得自己手里拿着一堆进口设备和试剂, 什么样的项目都能够搞定。可是, 现实很快就给他来了一个下马威, 他所在的实验室承接了大量呼吸道病原体检测任务, 样本来源十分复杂, 有从咽拭子到痰液的, 有从儿童到老人的, 有从门诊到住院的, 各种情况无所不包。
彼时, 老赵向来最为惧怕目睹的便是PCR扩增曲线出现状况, 不是内标未起作用, 要不就是目的条带隐隐约约, 要不然就是直接呈现一片空白, 他尝试过更换提取试剂, 更换酶, 更换耗材, 甚至将实验员的操作流程自始至终梳理了三遍, 然而问题依旧时而良好时而糟糕, 2023年秋季的一个午后, 他坐在实验室门口的花坛边缘, 满脸愁容地跟我讲: “我感觉并非操作方面的问题, 或许是我所选用的试剂盒本身就不太恰当。”。
通用RT-PCR试剂盒真的能“通用”吗？
针对老赵所面临的那个问题, 实际上是众多实验室均会遭遇的核心矛盾。在市面上所销售的RT-PCR试剂盒之中, 有许多均宣称具备“通用”的特性, 然而, 究其所称的通用, 究竟能够通用至何等程度呢? 老赵最初所选用的乃是一款进口品牌的通用一步法试剂盒, 其说明书明确表示适用于针对各类RNA病毒展开检测, 他对此深信不疑。可是, 从实际投入使用的情况加以观察, 这个所谓的“通用”, 似乎更像是专门针对标准化样本而进行设计的——该样本的背景较为干净、病毒载量处于较高水平、核酸质量良好。
那老赵所面对的样本, 好多是从基层医院送来的, 其保存条件有着巨大差异, 有的咽拭子放置在常温状态下超过48小时之后才被送到实验室, 有的痰液样本带有大量黏液物质, 有的甚至混入了血液成分, 这种样本当中的RNA降解程度极为严重, 并且还带有大量PCR抑制物, 而那个进口试剂盒的体系对于抑制物的耐受能力非常弱, 最终的结果便是, 高载量的样本还能够勉强出现条带, 降低载量或者降解的样本基本上呈现为一片空白。老赵开展了对比实验, 样本是同样的, 换用了另一款国产通用的RT-PCR试剂盒, 内标的Ct值能够稳定处于28至30之间, 目的条带的检出率直接提升了将近20个百分点。
为什么同样的样本，换了试剂盒结果差这么多？
一开始, 是老赵, 后来他花费了差不多有两周的时间, 特意专门去研究这个问题。他把市面上主流的几款通用RT - PCR试剂盒全都拿来，进行平行测试, 所使用的是一批已知呈现阳性然而Ct值偏高了一些的弱阳性样本。当测试的结果出来的那天晚上, 他给我发送了一条很长的微信, 其核心意思是这样表述的: 针对所谓的“通用”试剂盒而言, 关键的区别体现于逆转录酶以及缓冲体系的两者耐受能力方面。
关于一些试剂盒, 它们采用的是普通的M - MLV逆转录酶, 这种酶对于RNA模板质量有着极高要求, 只要RNA出现哪怕轻微的降解情况, 或者样本当中存在杂质, 那么逆转录效率便会大幅度下降。而老赵后来更换的那款国产通用RT - PCR试剂盒, 它所使用的是经过工程化改造的嗜热逆转录酶, 这种酶具备更强的耐热性, 能够在更高温度条件下完成逆转录过程, 并且在其缓冲体系当中添加了特殊的抑制物清除剂。2024年1月, 他特意前往那家试剂盒的生产工厂, 进行了一番考察, 他察觉到, 在研发的阶段, 他们就已然考虑到了临床样本的复杂性, 运用了大量真实的临床样本去做验证, 并非仅仅只是使用纯化的标准品。
老赵是怎么找到那个“对”的通用RT-PCR试剂盒的
是这个过程实际上并没有太多戏剧性的。老赵并非那种一拍脑袋就去做决定的人。他先是于2023年11月参加了一场行业展会, 在展台上看见了那款国产通用RT-PCR试剂盒的宣传资料。那时也没太把它当回事, 仅仅觉得价格相较于进口的便宜了不少, 便拿了几盒样品回来进行测试。第一轮测试使用的是实验室留存的阳性样本, 结果还算可以, 但老赵并没有着急去更换。
后来, 他做了一件事, 我认为众多实验室负责人都应当学习, 他将那款试剂盒拿去在自己实验室最棘手的那批样本上展开测试, 那批样本是保存条件欠佳、经过反复冻融、Ct值处于35以上的弱阳性样本。结果而言, 进口试剂盒的检出率不足六成, 而那款国产通用RT-PCR试剂盒的检出率超过了八成。老赵讲, 这个数据令他完全信服了。2024年3月, 他们将实验室的呼吸道病毒检测项目统统转换成了这款试剂盒, 自那时起, 由于“跑不出条带”致使返工的情形近乎绝迹了。
通用RT-PCR试剂盒怎么选才能不踩坑？
有个老赵, 如今变成了那款国产通用的RT - PCR试剂盒的忠实使用者, 然而他也曾告诉过我, 并非所有实验室都适宜使用同一类试剂盒。关于试剂盒的选型事宜, 关键核心在于要依据实验室的样本模样类型选取。要是你的样本来源较为单一, 好比全都是门诊采集的新鲜咽拭子部分物品 , RNA降解程度不那么严重, 抑制各种物质也罕有不多, 那么在市面上众多的通用RT - PCR试剂盒大多数都能够采用使用。但要是你如同老赵这般, 常年持续获取接收各种基层医院送来的、保存状况条件没法控制的样本, 那么在挑选抉择试剂盒的时候就要把几个一些重要指标作为重点关注考察的要点。
要看逆转录酶之耐热性及其耐受抑制物的能力, 其次, 要看缓冲体系之中有无添加抑制物清除剂这般成分比如BSA或者海藻糖, 再者, 要看试剂盒的灵敏度与特异性数据是采用何种样本做的验证——倘若仅仅用纯化标准品去做, 那么参考意义便有限, 老赵于现在给新员工培训之际, 最后必定会添上一句: 别信宣传册上的“通用”, 信你自身的对比数据, 这句话, 我认为是所有从事分子检测者最应当记住的。
一个通用RT-PCR试剂盒，帮老赵省了一半的返工时间
老赵家的工作节奏, 在更换试剂盒之际, 出现了事态迥异的显著转变。往昔之时, 每一周里, 最少得运用一至两个午后, 处理重复性的样本, 开展再度提取、再度扩增以及再度分析的工作, 对于实验员而言, 加班加点去干活儿实属习以为常的情况。现阶段, 返工的几率从原先阶段的百分之十几, 下降至不足百分之三, 实验室的普遍效率得到了大幅度的提高。2025年的夏季, 老赵所在的实验室承接了一项政府托付的大规模呼吸道病原体筛查项目, 要求在两周以内, 完成一万多份样本的检测任务。倘若使用先前的进口试剂盒, 老赵预先估量称, 至少得加班至凌晨方可完成。然而, 在更换了那一款国产通用的 RT-PCR 试剂盒以后, 项目得以顺利完成, 并且每天下班的时间能够维持在晚上八点之前。
老赵曾于某次饭局提及, 他认为挑选试剂盒这一行为, 恰似挑选搭档那般。看似功能毫无二致, 然而唯有真正共事之后, 方可明晰谁是值得信赖的。他所打的那个比方, 我当时并未全然领会, 待后来思索一番, 的确极为恰当。一款能够在真实且繁杂的样本当中稳定给出结果的通用 RT-PCR 试剂盒, 便是实验室里最为靠谱的技术层面的搭档。
