有个被我称作朋友的人是王磊, 他于一家处在苏州的生物科技公司担任研发主管, 其所主要从事的是基因检测这个领域, 他从事这一行业快要达到十年时间了, 平常与他打交道最为频繁的便是各类PCR试剂盒, 在相关圈子当中的人都了解, 对于PCR这般事物而言, 讲它简单的时候它确实简单, 然而讲它复杂的时候, 是能够让人流露出想要摔试管这般想法的。

去年夏天的时候, 王磊承接了一个规模较大的单子, 是为一家从事种猪养殖的猪场开展非洲猪瘟的大量筛查工作。甲方催促的节奏很紧凑, 表明三天之内必须得出具相应结果, 不然种猪的调运事宜就会失败。王磊没有说任何多余的话, 带领着团队即刻就着手开展工作。

PCR定量结果总是飘，问题出在哪？

就在前两天的时候, 所有情况进展得极为顺当顺遂。样本被进行提取, 然后是扩增, 接着得出数据, 整个流程开展得如同按照教科书那般精准无误。然而到了第三天, 王磊一直注视着电脑屏幕上所显示的CT值, 他的脸色变得愈发难看。针对同一个样本, 在上午的时候跑出来的最终结果呈现为阳性, 而到了下午, 更换了另外一个试剂盒再次进行检测, 结果却直接转变为弱阳性, 甚至出现阴性结果的情况都存在。他吩咐手下把原始的数据给调取出来, 进行反复地仔细核对, 最后发现其重复性糟糕得简直离谱至极。

将小刘的询问改写为: “磊哥, 咱们的提取步骤会不会存在问题? ”新来的小刘带着怯意问道。王磊摇了摇头, 提取流程是他亲自盯着的, 采用磁珠法纯化, 整个过程没有受到污染了。他又怀疑是机器出故障，连夜晚找工程师检查荧光定量PCR仪, 设备全部是正常的。问题究竟出在什么地方?

网上有人吐槽, 讲某些PCR定量试剂盒的配方稳定性欠佳, 批间差异颇大。王磊想起此事, 翻出仓库剩余的试剂盒, 认真查看批号与有效期, 皆是三个月内的新货。他随手取了一盒, 拆开核对组分, 猛然发觉稀释液里有细微的沉淀物。

如何选择靠谱的PCR检测试剂盒？

王磊察觉到, 或许是试剂盒自身的质量存在着高低不一的状况, 他拨通电话给圈子里的一位老哥, 这位老哥在广东从事第三方检测工作, 具备丰富的经验。老哥倾听完他的叙述后, 直接说道: “你这家伙是不是贪图便宜, 购买了小厂家生产的散装货品呢? 定量PCR这个事物, 其关键在于酶与引物的匹配程度。你所使用的那个品牌, 我在去年就遭遇过问题, 批次之间的差异大得惊人, 后来就全部更换掉了。”。

王磊这时才回忆起来, 这批试剂盒是采购部临时更换的供应商, 声称价格便宜三成。他那时忙于赶项目, 也未曾仔细查看。如今可好, 数据无法使用, 工期将会延误, 甲方那边已然打电话前来催促了。

他马上吩咐采购再次购置了一批在业内被大家一致认为口碑优良的PCR定量试剂盒, 其组分当中添加了经过优化的缓冲系统以及热启动酶, 听说能够切实有效地减少非特异性扩增。货物送达之后, 王磊亲自带领着团队再度进行了一遍验证实验。这一回, 对于同一个样本, 三次重复所得到的CT值相互之间相差不足0.5, 重复性一下子就提升起来了。

PCR定量试剂盒的保存条件影响有多大？

数据处于稳定状态了, 然而王磊却没敢有丝毫的疏忽大意。他认真地查看了新试剂盒所附带的说明书, 那上面清晰明确地进行了记载: 要是需要长期保存的话, 必须处于零下二十摄氏度以下的环境, 同时要防止出现反复冻融的情况。他回想起了旧试剂盒的存放具体情形——仓库里面的冰箱总是被众人随意地进行开关操作, 致使温度一会儿高一会儿低, 偶尔早上查看时显示为零下十八摄氏度, 可到下午的时候就已经攀升到零下十摄氏度了。在这样的一种环境状况之下, 酶的活性以及引物的质量必然会出现降低的情况的。

他还查阅了不少行业方面的资料, 发觉好多实验室于PCR定量进程当中出了差错, 并非是操作方面存在问题, 而是试剂盒的储存以及使用的细微之处没有落实到位。像是PCR定量试剂盒里头的荧光染料, 对光线敏感, 长时间处于强光之下会发生淬灭现象, 致使荧光信号变弱, CT值自然而然就出现波动了。

王磊特意为团队开展啦一次培训, 提出要求, 所有试剂盒一旦开封之后, 就必须进行分装保存, 以此来避免出现反复冻融的情况。而且, 他还购置了一批避光盒, 将试剂盒放置到里面, 以此确保每次在使用之前, 都要去检查温度纪录, 这些细节瞅着是挺琐碎的, 然而它却直接决定了实验结果的可靠性。

不同样本类型对PCR定量性能有影响吗？

那个项目最终顺利地呈现出交付的大结局, 甲方对于其结果抱以十分满意的态度。然而王磊并未在达成如此状况之后就此停止手中的行动。他脑海之中不停地思索着, 究竟是出于何种缘由, 致使同样一款PCR 定量试剂盒, 于不同的样本类型之上所展示出来的表现差异会如此巨大呢? 举例来说, 像血清样本以及粪便样本这两种, 经过提取之后所获得的核酸纯度竟然是不一样的, 并且其中残留下来的杂质竟然会对PCR反应产生阻碍抑制的作用。

他特意进行了一组对比实验, 这组实验中分别用到了血液, 还用到了组织匀浆, 另外也用到了拭子样本, 这些样本搭配的是同一一款PCR定量试剂盒, 目的是要看扩增效率。后来结果发现, 拭子样本所呈现的扩增曲线最为好看, 而组织匀浆样本要是提取得不够彻底, 就容易出现假阴性的情况。血液样本呢, 是由于其中含有血红蛋白等抑制物, 所以需要搭配专门的去抑制剂试剂盒。

王磊将这个经验撰写成了内部操作手册, 接着把它分发给了团队。随后，在一期一次的行业交流会上, 他提到了这个案例, 台下不止几个的人点头, 纷纷表明碰到过相似的问题, 只是不晓得怎样去排查。

荧光定量PCR试剂盒的灵敏度怎么验证？

今年三月份的时候, 王磊所在的公司着要去申报一个省级科研项目, 这个项目是需要提供相关实验数据的。其中存在一个关键指标, 此指标就是PCR定量试剂盒的灵敏度, 而灵敏度也就是最低检测限。王磊把之前已经验证过的数据拿了出来, 却发现有一些低拷贝样本的检出率呈现不稳定的状况。

他查找了最新的行业标准, 发觉灵敏度验证不能仅看理论值, 得用实际样本做梯度稀释测定。王磊带领着团队, 将标准品从高浓度一直稀释到理论上的单拷贝级别, 接着用PCR定量试剂盒逐个检测。多次做了五次实验, 明确了这款试剂盒在实际操作里的下限。

他另外发现, 灵敏度与试剂盒当中聚合酶的保真度紧密相关。存在某些酶在高循环数情形下易于失活, 致使低拷贝样本无法被扩增出来。王磊毅然决然更换了另一款具备高保真聚合酶的PCR定量试剂盒, 最终灵敏度提高了将近一个数量级, 顺利通过了项目评审。

如今, 王磊于每次采购之前, 都会率先开展小批量验证, 对批间差以及灵敏度予以测试, 而后才判定是否进行大批量进货。他时常跟同行讲, PCR定量试剂盒究竟好不好, 并非能够仅仅依据宣传来判断, 而是必须自己动手去尝试, 特别是那些细节参数, 其直接决定着你所进行的实验能否成功做出来。