在生物技术这个圈子内, 我结识阿梁已快十年, 他是我的老朋友, 他和我相比大两岁, 其性格沉稳, 进行做事时一丝不苟, 他本科念的是生物工程, 硕士毕业之后直接进入一家从事抗体药物的公司, 负责细胞培养这一方面, 他总是自我调侃讲, 自己就是个从事细胞培养的人, 然而这工作倘若真要出色完成, 没有三五年的磨砺, 根本无法胜任, 我平常碰到细胞培养方面的难题, 最早想到的就是给他致电。
去年夏季的时候, 我邀约阿梁去用餐。那段时间我正被自己手头那几个实验搞得疲惫不堪, 细胞老是生长得不理想, 要么遭受污染, 要么状态不佳, 数据根本没办法使用。阿梁听完我的抱怨, 微笑着说他自己也刚刚遭遇了一个严重挫折。
2025 年 5 月便开启了相关事情, 阿梁所在的团队承接了一个新项目, 需于两个月内做完一批具有高密度的细胞培养, 以此来用于后续的蛋白表达验证, 时间紧迫, 任务繁重, 阿梁起初是颇具信心的, 毕竟他在该行业已然工作了六年, 常规的细胞培养流程就算闭着眼睛也能够完成, 像培养基的配比、传代的时机以及培养箱的参数等, 他都已经牢记在心。
细胞培养第一步，为什么总是污染
阿梁讲, 那批细胞才刚复苏之际, 瞅着状态挺好。他依照老习惯, 采用了先前始终在用的培养基以及血清, 操作台实施了严格消毒, 所有器皿均预先进行灭菌。然而第一批培养至第三天时, 在显微镜下就呈现出异常状况。在几个培养瓶里头, 细胞周边多出了一些细小的、持续晃动的颗粒, 有的地方还出现了浑浊的团块。
当时, 他脑袋瞬间嗡的一下, 其第一反应便是觉得被污染了。细菌、真菌以及支原体, 在细胞培养这个范畴里, 这些词汇宛如“鬼故事”一般, 谁都不愿遭遇。阿梁赶忙将所有存有疑点的培养瓶都进行隔离, 随后重新进行取样检测。待结果出来之后, 他不禁倒吸一口凉气, 竟是支原体污染。
“支原体此物堪称最为烦人的存在, 它并非如那般细菌一样, 能够一眼便清晰地看出来, 在诸多时候, 细胞依然是可以生长的, 然而其状态却是在逐渐地变差, 就连数据亦是飘忽不定的。”阿梁轻抿了一口啤酒, 眉头紧皱着说道, “我在那时候, 每一天都紧紧地盯着显微镜去看, 几乎都快要形成心理阴影了。后来我才终于意识到, 或许是我所使用的那一批血清存在着问题, 抑或是在操作的过程当中, 哪一个微小的细节未曾留意到。”。
他向我讲述, 细胞培养这项工作, 较量的便是细节。污染的源头不外乎这几个方面: 操作的环境, 培养基以及血清, 器皿和耗材, 还有操作者自身。许多人认为在超净台里喷洒酒精便大功告成, 实际上远远不足。细胞培养对于无菌环境的要求, 较大多数人所想象的严苛许多。那次之后, 阿梁将整个操作流程再次有条不紊地整理了一回, 甚至把培养箱的隔层拆卸下来进行彻底的清洗并灭菌, 又更换了一批全新的培养基和血清, 这才好不容易稳定住了局面。
细胞培养状态差，到底该从哪里找原因
费劲千辛万苦好不容易才将污染的问题给控制住了, 此时还没等阿梁能够舒缓一下紧张的气息, 新出现的难题麻烦便又再次降临了。那一批细胞尽管没有再次出现污染的情况, 然而其生长的速度却格外缓慢, 并且细胞呈现出来的形态也是不正确的。正常情况下进行贴壁的细胞应当是呈现舒展状态的, 并且其边缘是棱角清晰分明的, 可是在他当时所看到的那些细胞看起来却是又小又呈现圆形的样子, 其中还有一部分是漂浮在培养液当中的, 活生生地就好像是处于一种“营养缺乏不良”的状态。
阿梁尝试了好些种办法, 调整血清的浓度, 更换培养基的品牌, 缩短传代的周期, 降低培养的温度, 能想到的法子都试过一回, 然而收效颇为微小。那段日子他压力极大, 项目的进度已然落后, 领导每日催促, 组里的技术员也随之紧张起来。阿梁讲, 他有一晚待在实验室中, 对着显微镜发呆, 觉得自己好似一只无头苍蝇。
阿梁眼睛亮了一下, 说道, 后来有一位在细胞培养方面时间持续更久的前辈给了我一句指点, 他讲, 你仅仅只是盯着细胞自身去看是没有作用的, 必须要朝着上游方向去探寻原因, 细胞呈现出的状态不佳, 在很多情形下是作为源头的种子细胞自身就已经出现了问题。
使阿梁一下子明白的是这句话, 他找出这批细胞的冻存记录, 发觉当初冻存时, 细胞密度写得不清楚, 他复苏后没做更精细的活率检测, 直接依照经验传了一代便开始铺板, 他赶忙重新复苏了一批新的种子细胞, 这次每一步都严格地记录, 复苏后先进行台盼蓝染色, 活率低于90%的绝对不使用, 同时, 他还对培养基的配方做了调整, 在基础培养基里额外添加了谷氨酰胺和丙酮酸钠, 给细胞补充能量。
诚然, 细胞的状态以肉眼能够察觉到的态势明显地好转起来。直至第四天, 培养瓶当中的细胞已然生长得极为密集, 铺展成为均匀的单层, 于显微镜下观察过去, 其形态饱满, 边界明晰, 恰似一片规整的稻田。阿梁于此方才长舒一口气。他清楚, 真正的生产流程, 终于能够步入正轨了。
细胞培养扩增慢，怎么才能提高效率
细胞状态实现稳定以后, 随即迎面而来的便是扩增阶段了。该项目明确规定, 要于一个月时间内, 将细胞数量由几百万加以扩增, 直至成为几十亿, 就这样的数据量级层面而言, 针对往常一贯存在的那种贴壁培养活动来讲, 其涉及到的困难系数着实不低呢。阿梁起初所选用的乃是传统样式的T175培养瓶, 单单凭借一个瓶所能培育的全部总数, 最终也就不过勉强达到两三千万个细胞数额, 并且还极其需要频繁地开展换液以及传代等操作, 如此一来, 人工所需耗费的成本便高高在上了, 操作的次数更是繁多重重, 于此同时, 污染所面临的风险也伴随这种情况而跟着成倍地攀升上去了。
阿梁进行了一番算账, 要是依照这个节奏, 仅仅是换液以及传代, 每一天都会耗费他大半天的时间, 根本没办法满足项目进度, 并且培养瓶所占用的培养箱空间也是很大的, 实验室里总共就只有那么几台培养箱, 全部堆满也凑不齐需要的细胞数量。
阿梁讲那些曾经, 他那时节是实实在在着了急的, 整日整日都在思索怎样去提升效率。之后他查阅了数目繁多的资料, 还同行业内的人士进行了一番交流, 发觉好多人早就摒弃了仅仅依靠贴壁来开展培养的方式，他们早就采用了微载体或者悬浮培养的工艺。然而他所拥有的这个细胞系对贴壁存在依赖, 径直改为悬浮模式是不切实际的, 最终他下定决心去尝试运用多层细胞工厂。
阿梁讲述的多层细胞工厂, 实际上是一种内部具备诸多层板结构的培养容器, 这等同于将数个培养瓶并排叠加所致后果, 会大幅增添培养涵盖面积。他向供货商索要并获取了一些样品, 进行了连续两批的测试运用, 其呈现效果超乎预先认知范围地优异。细胞于多层板之上的贴壁状况以及生长态势均颇为匀称适宜, 并且在进行换液操作以及收获环节时, 整个程序变得简便容易许多。
就是这样, 阿梁将原来所有的T175瓶统统替换成了多层细胞工厂, 培养的面积一下子增大了差不多十倍之多, 每一个批次能够收获到的细胞数量为此也实现了成倍递增, 由于扩增的效率有所提高, 项目的进度最终追赶并获得了大部分所延误的时间。
细胞培养关键参数，新手最容易忽略什么
处于六月中旬之际, 阿梁所负责的项目步入最为关键的蛋白表达时期。细胞量已然积攒充足, 紧接着要开展诱导表达工作。参照先前的经验看来, 这一环节最怕碰到的状况，便是细胞代谢状态呈现出不稳定情形, 进而致使表达量无法提升上去, 或者致使产物质量欠佳。
阿梁汲取了先前的教训, 此番格外谨小慎微, 他每日都要记录培养液当中的葡萄糖浓度, 还要记录乳酸浓度, 以及pH值, 还有溶氧量, 并且特意购置了一台便携式的生化分析仪, 每一次取样都要测量一遍。组里新入职的技术员小刘认为他太过吹毛求疵, 觉得大致差不多就可以了, 没有必要每日进行测量。阿梁没有跟他过多阐释, 仅仅说了一句: “细胞培养这件事情, 差一点点, 结果就会相差很远。你要是不紧盯这些参数, 它就会出状况给你看。”。
的确, 到了诱导之后的第三天, 阿梁发觉一个培养单元当中的乳酸浓度忽然间升高了许多, pH也下降到了7.0以下。他马上断定是细胞密度过高, 代谢废物积攒速度太快, 致使微环境恶化。他果断迅速地, 给那个单元更换了半量的新鲜培养基, 与此同时降低了培养箱的二氧化碳浓度, 将pH稳定住。
在第二天的早上之际, 小刘于看到显示出数据已然恢复得正常状态的报告以后, 朝着阿梁竖起了大拇指。阿梁说道, 存在着许多事物并非是在书本之上能够被教会的, 你是必须要自己亲身经历过吃亏的情况、踩过坑的状况才可以真正记住的。
细胞培养出问题，如何快速找到解决方案
终于, 耗时许久的项目, 于七月中旬, 顺利地完成了。蛋白的表达量, 较预期而言, 竟然高出了15%, 并且, 所有的检测结果, 均为合格。至此, 阿梁紧绷着的神经, 终于放松了下来。在周会上, 公司领导特意点名, 对他进行了表扬。然而, 只有阿梁自己心里明白, 一路走来, 每一道难关, 都是在不断尝试犯错, 进行总结, 向他人请教, 持续学习之后, 才得以跨越过去的。
上一个月, 我俩再次谈及了这件事情, 阿梁讲, 他随后将整个进程里碰到的全部问题、缘由辨析、处理办法都归纳成了一份详尽的操作指南, 发送给了小组里的每一个人。他还把那个文档分享到了几个行业内交流群组, 结果好多人私下给他发消息说“非常实用”。阿梁跟我讲, 实际上细胞培养这个范畴, 很多疑问前人早就碰到过, 只是大家平常各自忙各自的事情, 信息传播不够充分。要是有人能够把经验有条理地梳理出来, 对于新人而言能够少走许多冤枉路。
我向他询问, 要是针对刚进入行业的人给出一句话的建议的话, 你会讲些什么。阿梁思考了一番, 说道: “不要惧怕出现问题, 然而要学会从问题当中挖掘出东西来。每一回的污染, 每一次细胞状态的波动, 都是你提升工艺水平的契机。不要仅仅只关注浅层的现象, 要朝着深入去思考, 朝着上游探寻原因。细胞培养并非是玄学, 它属于科学, 每个变量都是有踪迹可以追寻的。”。
电话挂断之后, 我于电脑跟前坐下, 将阿梁所讲之事再次梳理了一回。说实话, 从事生物实验工作之人, 哪有没遭受过细胞培养之困扰的呢。然而正如阿梁所讲, 只要你乐意静下心, 把控好进程状况, 紧盯住细节之处, 那些曾经带给你困扰的难题, 终有一日会变为你经验宝库中最为珍贵的一部分。
