一个做基因检测的朋友，最近被“酶活性”搞得焦头烂额
我存在一位被称作老周的友人，处于长三角地区一家第三方生物检测实验室范畴内担任技术主管职务, 专门针对细胞功能分析这一领域予以负责。该项工作开展了将近七年时间, 经由其手里的样本数量起码也得有上万份规模。按照一般常理推断, 何种实验他未曾见识过呢?
但今年三月份，他被一个“酶活性检测”的项目卡了整整两周。
有一家从事肿瘤早期筛查的初创客户公司, 寄来的样本数量不算多, 然而对于检测结果的重复性以及线性范围有着极高要求。老周起初并未予以重视, 随手就采用了实验室一直所使用的那款老牌试剂盒。结果第一批数据呈现出来, CV（变异系数）飙升至15%以上, 就连基线都飘忽得极不合理。
酶活性检测试剂盒怎么选才对？老周踩过的坑你未必知道
老周跟我在喝酒这个行为进行当中的时候, 发起了吐槽, 宣称在那两周的时间段之内, 他几乎是把实验室里能够进行更换操作的条件全部都更换了一遍, 具体情况如下: 孵育温度从原本的37℃调整到了30℃, 反应时间从起初的30分钟延长到了60分钟, 甚至于把样品稀释倍数由原来的10倍改变为50倍。那么最终的结果又是怎样的呢? 数据呈现出的状态依然是忽高忽低, 犹如乘坐过山车一般。
过后, 他安静下来, 对事情进行重新审视, 发觉问题压根不是出在操作方面, 而是出在试剂盒自身的配方逻辑上。
现如今, 市面上所售的酶活性检测试剂盒中, 其核心原理不外乎是, 底物跟酶展开反应之后, 生成了有色或者荧光产物, 接着借助吸光度亦或是荧光强度去实施定量。然而呢, 不同品牌的试剂盒, 于底物选择方面, 在缓冲液体系这件事上, 以及稳定剂配方这块, 存在着极大的差异。其中有的试剂盒, 为了能够延长保质期, 运用了大量的防腐剂, 可反倒抑制了部分酶的活性；还有的试剂盒, 其底物浓度标称得非常高, 但实际上批次之间的差异大到了离谱的程度。
老周所拥有的那款较为老旧的试剂盒, 存在着称得上典型的“底物不稳定”状况。对于同一块96孔板而言, 位于左边的孔与处于右边的孔, 它们各自的反应速率并不相同, 如此一来数据当然也就没办法得以观瞧了。
换了个试剂盒之后，老周的数据终于稳住了
清明节过后, 老周最终拿定主意更换试剂盒, 他挑选了三个品牌去做平行对比, 最后留下了一款国产品牌的新品, 这款试剂盒最大的特性是底物运用了微胶囊包埋技术, 听说能够极大程度降低底物在溶液里的自发水解速率。
老周运用自身的标准酶开展了一组验证, 存在五个浓度梯度, 进行了三次重复 , 持续测定了三天。结果呈现出来, CV值全都控制在了3%以内 , 线性相关系数R²达到了0.999。他当场就给客户拨打了电话 , 告知可以重新进样了。
客户那方也十分地开心, 缘由是老周这次仅花费三天便给出了整套数据, 并且每一组的重复性都完成得极为出色。还有, 对方实验室的负责人后来特地打电话询问老周所使用的是什么试剂盒, 同时表明他们自身内部也正在寻觅稳定的检测方案。
酶活性检测试剂盒的稳定性到底有多重要？
你可能觉得，不就是个试剂盒吗，能差多少？
我这般跟你讲, 于酶活性检测此领域, 稳定性径直决定你实验结果能否被重复得出。一个不稳定的试剂盒, 往轻了说会使你耗费多一周时间去做验证, 往重了讲则会径直致使你整个实验批次作废。尤其在开展酶抑制剂的筛选实验之际, IC50值的偏差有可能从纳摩尔级直接跃至微摩尔级, 这般后果谁人能够承受?
老周讲, 他如今每回进入新一批次的试剂盒时, 首要之事乃是拿标准酶去做一回全流程验证, 待确认CV值处于可接受范围之内后才正式投入使用。这般习惯, 乃是被他上次那个出现问题的项目给逼迫形成的。
做酶活性检测，别忽视说明书里的细节
老周跟我分享了个细节, 他换上新试剂盒后, 仔细瞧了瞧说明书, 发觉这款试剂盒所推荐的稀释液并非常见的PBS, 而是一种含有特定金属离子的缓冲液。他进行了一次试验, 果然灵敏度相较于使用PBS时提高了将近30%。
诸多进行检测的人, 常常在获取试剂盒之后按照自身经验去操作, 全然不去查看说明书之中的缓冲液配方, 不去留意反应温度，同样也不关注终止液添加顺序这类细节。然而恰恰就是这些细节, 决定了你最终所得到的究竟是可靠的数据, 还是如同废纸一般毫无价值的东西。
哪怕是酶活性检测试剂盒, 不同品牌的它对于样本基质的耐受能力也是存在差异的。一些试剂盒对于血清样本内部的脂质格外敏感, 只要稍微呈现出些许浑浊状态, 吸光度就会偏离到极为离谱的程度。然而另外一些试剂盒借助优化表面活性剂配方, 能够直接承受高脂样本, 可以无需进行样品先前处理的时间操作。
最后说两句
老周如今形成了一种习惯, 每间隔三个月, 他便会主动去联系试剂盒供应商, 询问有无新的技术迭代或者是升级版。他认为, 开展实验这件事, 吃几年现成的经验是可行的, 然而若想要始终得出高水平的数据, 那就必须持续紧跟行业的技术发展进程。
要是你同样正为酶活性检测的稳定性而犯愁, 那不妨跟老周那样, 大大地去换个试剂盒尝试一下。别害怕折腾一番, 之所以怕, 是因为你一直使用着不合适的工具, 还自认为是自身的操作存在问题。
毕竟，工具选对了，事半功倍。
