上周五夜里十一点, 我接到老周打来的电话, 电话那头他的声音有些疲惫, 却又带着一丝兴奋, 他说: “兄弟, 终于弄好了, 若不是你先前跟我讲的那一批PCR试剂盒, 我这个项目真的会失败。”。
我认识快十年的朋友是老周, 他在一家第三方医学检验所担任技术主管, 说是主管, 可事实上是个啥都必须管的角色, 从设备维护开始, 到试剂采购, 再到实验流程优化, 事事都要操心, 他所在的检验所规模不大, 然而接的单子却不少, 主要是给周边几个县市的疾控中心以及卫生院做传染病检测。
今年三月份的时候, 他们忽然接到了这样一个大工作, 一个区级的疾控中心要求他们去承担一批应急检测的任务, 时间非常紧迫, 样本数量特别大, 还要求在七天之内给出结果。老周那时满怀兴致地接下了, 认为这是所里扩展业务的一个很好的机会。可是没过两天, 他就发觉事情并非那么容易。
为什么PCR试剂盒的灵敏度这么重要
老周以往用来进行PCR检测的试剂盒始终来源于一家有着较长经营时间的供应商处, 产品价格并没有具备较低的优势, 然而存在显著特性即具备稳定性。可是这次所布置的任务对于需要检测的病原体来说有着特殊的类型, 那家供应商所供应产品无法全面含括所有范围, 并且具备很低的灵敏程度不足以有效检测。老周开展了一次预先性的检测实验, 结果发现对于浓度较低的样本能够检测出来的概率仅仅只有百分之七十多罢了, 这就表明存在数量不少的呈现阳性的样本很有可能会被遗漏掉。
当时他着急了, 给我打电话讲, 兄弟, 有一个阳性被漏检了, 如此情形后续会传染出去多少人, 这般责任我实在担当不起。而后我说道, 那样的话你唯有更换试剂盒才行。他神情无奈地叹了一口气, 表明换掉是不难, 可换完以后整个流程都得再次去进行验证, 然而当下时间是不够用的。我又讲, 你要是再这么拖延下去, 时间就会愈发不够用。
他咬了咬自己的牙, 接着启动四处打听的行动, 去探寻看哪一家的PCR试剂盒灵敏度程度高, 并且覆盖范围全。他翻阅了几个涉及检测行业领域的论坛, 向为数不多的几个同行朋友进行问询, 又查看了几家不同品牌所产出被称作技术白皮书的东西, 最终确定锁定了两个可供选择备用的目标。
怎么判断PCR试剂盒的批间差是否稳定
做事极为谨慎的老周, 不会单单只看参数, 他向两家不同的公司索要了试用品, 亲自动手去做批间差测试, 那批间差是什么呢, 它指的是, 不同批次生产出来的试剂盒, 针对同一个样本进行检测时, 其结果能否维持一致。
他开展了为期三天的实验, 每日所采用的是同一批样本, 分批运用不同批次的试剂盒去运行一轮。其最终所示结果为, 对于一个品牌的试剂盒而言, 在连续三天的时间里, Ct值呈现出极为显著的波动状态, 最大差值多达1.8个循环；然而, 另一个品牌的试剂盒, 其波动幅度成功控制在了0.5个循环以内。老周据此选择了后者。
后边他同我讲, “进行检测时最担忧的便是, 今日呈现阳性，明日却变为阴性, 在样本尚无变换的情况下, 试剂率先发生变化了。批间差异显著的试剂盒, 是根本不敢加以使用的”。
于此我欲言, 设若乃从事检测者, 此批间差之指标势必要于采购之前予以验证。纵然参数看似漂亮那亦是无用之物, 惟实操是否稳妥方为关键所在。此次老周之选择无误, 于其后之大批量检测进程里, 针对同一样本于不同时刻以及不同批次情形下, Ct 值几近未出现漂移现象, 结果之一致性极为良好。
采购PCR试剂盒时要注意哪些参数
老周在确定品牌之后, 便着手开始仔细查看参数, 他向我列举了几个关键要点, 分别是靶基因覆盖范围, 检测下限, 扩增效率以及交叉反应率, 他表示靶基因覆盖范围格外重要, 原因在于此次检测的病原体变异速度较快, 倘若试剂盒仅仅覆盖了保守区, 一旦出现变异情况, 就极有可能导致漏检。
他测过检测下限, 那家试剂盒能够稳定地去检出每微升含有十个拷贝的样本。他算过扩增效率, 斜率接近于负三点三, R²值在零点九九以上, 这表明线性关系是很好的。他也做了交叉反应率, 使用了十几个近缘病原体的核酸样本, 全部呈现为阴性, 不存在假阳性的出现, 这便是全部情况了。
他特地向供应商询问了一个细节, 即试剂盒里是否有内置内参。供应商表示有, 并且内参基因的扩增曲线与靶基因的扩增曲线互不干扰。老周称这一点极为重要, 因为内参能够监控核酸提取以及扩增过程是否存在问题, 要是没有内参, 当结果出现异常时, 根本无法知晓是样本的问题还是试剂的问题。
PCR试剂盒储存和运输条件有多严格
老周当时碰到了一个麻烦的状况, 时间如此紧张, 试剂盒能否按时抵达，并且储存条件能否得以确保。
他往昔曾吃过亏, 有一回于夏天所进的试剂盒, 在运输途中冷链断了一回, 到货之际里面的冰袋皆已融化, 他那时未做仔细检查便使用了下去, 结果致使一批样本全然出现问题, 随后重新购置了试剂盒才得以补测回来, 耽搁了三天时间。
这次, 他留了个心眼, 特意跟供应商确认了运输方案, 那就是全程冷链运输, 温度记录仪要随箱放置, 到货之后要先查验温度曲线然后才能签收。到货当日, 他亲自盯着, 打开箱子一看, 温度记录显示全程的温度处于二到八摄氏度之间, 且冰袋还是硬的, 这时他才放心地将其入库。
于储存范畴, 他依据说明书将试剂盒予以分类存放, 对于酶类试剂放置于零下20摄氏度之处，而其他部分则放置于2到8摄氏度的地方。他还特地于冰箱门上粘贴了一张标签, 其上书写有过期日期以及开瓶日期, 以此便利后续进行追溯。
怎样提升PCR试剂盒的使用效率
量那么大的任务, 仅试剂盒状况尚可还不行, 老周还在思索怎样去提升效率, 他将实验流程进行了优化, 把样本核酸提取以及PCR体系配制的时间错开, 由两个人交替去操作, 达成流水线作业效果。
原先是, 他们一天当中, 最多能做三百个样本, 经过优化以后, 一天能够做到五百个。他讲, 这事项同试剂盒是存在关联关系的, 那家试剂盒的预混液是即可以使用的类型, 不需要自己单独去配制各种各样的组分, 仅仅直接添加模板以及水就可以达成, 节省下来了相当多的时间。并且, 扩增程序同样是较快的存在, 标准程序仅仅需要八十分钟, 相较于市面上众多的产品, 快出来了二十分钟。
老周还讲了一点, 试剂盒说明书的详细程度是很关键的。他曾使用过一款试剂盒, 其说明书存在诸多错别字, 操作步骤表述模糊, 他致电询问技术支撑, 对方也未能清晰解答。现在这款试剂盒的说明书步骤明晰, 并且附带了常见问题排查指南, 即便新手依照其操作也不会出现差错。
到第五天之际, 老周他们完成了百分之九十的检测任务, 所有阳性样本皆被准确检出没出现阴性样本误报情况如此种种得到了疾控中心负责人打来电话表示认可, 老周长长地舒了一口气。
他在那之后请我吃饭, 然后端起了杯子, 对着我说: “倘若这次不是更换了那一批PCR试剂盒, 我估摸就要出状况了。哪怕参数再好, 要是不亲自去验证一下, 心里终究是不踏实的。并且, 拣选对了试剂盒, 整个流程都顺畅起来了, 就连带着团队也轻松了许多。”。
我向他询问往后是否还会更换供应商, 他讲短期内不会, 缘由是已经验证过了, 要是更换新的那就又得重复折腾一回。不过他也阐明会定时留意市场上的新品, 倘若有更优质的, 能够开展对比测试, 以此保证技术不落后于他人。
这便是老周的经历, 要是你正因PCR试剂盒之选犯愁, 那就不妨如他那般，从灵敏度、批间差、参数之细节、储存运输、使用效率这些层面予以考察, 别光瞅价格, 也别仅看品牌, 亲身做上几轮验证, 胜过看一百份宣传资料, 毕竟, 检测这事, 结果有误便为零, 不存在中间数值。
