一次实验失败的教训
前月, 我那位于北京中关村一家从事生物科技的公司担任技术支撑工作的朋友老张, 给我拨来一通颇长的电话, 老张今年三十二岁, 开展PCR实验快达八年之久, 称得上是实验室里的经验丰富者, 他在电话里语调略显沉闷, 称近期被一个实验项目折腾得甚是疲惫。
情况是处于这样的状态的。老张以及他们所在的实验室承接了一项涉及基因表达分析的横向课题, 此课题要求运用科研PCR试剂盒去开展大批量样本的检测工作。依照过去一贯的思维方式, 老张径直选择了一款在市面上较为常见的普通PCR试剂盒, 心里觉得既然是老品牌的, 那么应该是不会出现问题的。然而当第一批实验数据呈现在眼前的时候, 他整个人陷入了极度惊愕的状态。
那扩增呈现出的曲线杂乱无章, 荧光所产生的信号状态甚是飘摇不定, 其重复性糟糕到了令人发指的地步。他趁着连夜的时间段重新检测再三, 然而每一回得出的结果居然都不尽相同。老张朝着我讲道: “我历经这么多年的实验历程打拼, 在心灵感知上头一回涌现出自己不再会操作PCR技术这项实验的想法。”。
我心里明白, 这压根就不是老张所存在的技术方面的问题, 而是试剂盒自身并不契合他此次实验的具体需求。科研PCR试剂盒这般事物, 看上去似乎都是大致相同的, 可实际上对于样本类型、基因靶点以及扩增效率的要求存在着极大的差异。要是选错了, 即便操作再怎么熟练那也是徒劳无功的。
科研PCR试剂盒怎么选
老张在那之后, 花费了两周的时间, 将自己闭锁于实验室之内, 针对市面上主流的好几款科研PCR试剂盒, 全都进行了一番检测。他为我罗列了一项选型标准, 我认为其具备实用性。
首先得看试剂盒所适用的机型, 老张实验室所采用的是Bio-Rad CFX96, 存在一些试剂盒在这台机器上展现出良好表现, 然而更换至其他品牌机器时便会出现“水土不服”的状况, 老张称: “扩增曲线无法跑出来的情形, 一大半是由于试剂盒与机型不匹配造成的。”。
首先得看, 试剂盒对于样本类型的那个适配程度。老张他们此次所做的样本, 乃是石蜡包埋组织提取出的RNA, 这种样本的核酸质量较为糟糕, 存在着高降解风险。普通的科研PCR试剂盒, 对于这种样本具备的扩增效率很低, 必须选做专门针对降解样本予以优化的产品。
第三个方面要看的是试剂盒的灵敏度, 老张此次情况下目标基因的表达量是很低的, 这就需要检测出极为微量的转录本, 普通试剂盒所拥有的检测下限是达不到相关要求的, 所以只能选择高敏型的, 后来他换到了一款高敏科研PCR试剂盒, 结果扩增曲线一下子就清晰了。
他特别强调的第四个点是，要看试剂盒的批次间稳定性。老张说, 有些便宜的试剂盒, 这一批和上一批用起来完全不一样。他还表示, 如果你做大批量实验, 批次间差异就是灾难。
第五个方面是试剂盒的保质期以及存储条件, 老张先前购入过一款需要进行全程-20℃运输的试剂盒, 然而物流出现了耽搁现象, 耽搁时长为两天, 等到货物到达的时候, 冰袋已然融化了, 他直接将一批试剂予以报废处理, 损失颇为重大, 自那之后, 他仅仅会去查看那些能够耐受短时间室温运输的试剂盒。
我的反复确认过程
老张跟我讲, 他最初踩到那个坑, 原因在于过度自信。他是这么觉得的, 自己做PCR好多年了, 心想无论选哪一个试剂盒, 都肯定能够用。然而, 科研实验跟临床实验可不是一回事儿。科研PCR试剂盒所要面对的, 是各种各样、形形色色丰富多样的样本类型以及各式各样、纷繁复杂的实验设计, 根本就不存在所谓“万能”的那种试剂盒。
后来, 他花费了三天的时间, 将自身实验室未来的项目需求全部罗列出来, 项目一共有四类, 分别是基因表达分析、基因编辑后的鉴定、病毒载量检测以及稀有突变检测, 每个项目对试剂盒的要求均存在差异, 他向领导提出申请, 把这几个项目所需的试剂盒分开进行采购, 而非为了省事仅仅去购买一款。
一开始领导觉着他是把小问题夸大为严重的举动。随后老张将先前实验失败时的数据以及重新进行测试后得出的对比数据陈列出来, 领导看过之后直接批准了预算。老张跟我讲: “从事实验工作的人不可以惧怕麻烦, 在较前的阶段要多做几次仔细的确认, 在靠后的阶段就能少几次伤心的哭泣。”。
具体时间地点的遭遇
三月中旬的时候, 于今年, 老张在上海, 于参加一个学术会议期间, 碰到了一家试剂盒厂商的展台。他那时随口质问了一句, 说是 “你们试剂盒能否开展进行石蜡样本的相关操作”，销售则用力拍拍胸脯, 声明讲绝对不会出现问题。老张并未当场去下单购物, 先是索要了试用装, 而后带回北京。
结果把那试用装拿去测试, 经过检测发觉其扩增效率的确要比他们当下正在使用的那一款来得高。然而老张留了个心思, 他先将试用装做了三批重复实验, 随后又把正式装也做了三批重复实验。最终发现, 试用装的那些批次之间的 CV 值处于 3%以内, 而正式装的 CV 值却抵达了 8%。于是他便去询问对方, 对方说话吞吞吐吐, 称可能是运输条件产生了影响。老张于是直接放弃了这一款。
他对我讲, 试用装跟正式装的品质并非相同, 像这种试剂盒, 你会敢去使用吗, 做科研用的PCR试剂盒, 最担忧的便是外显情况和实际情况不一致。
比选过程中的关键决策
在五月初的时候, 老张后来选定了两款作为备选的科研PCR试剂盒, 一款是进口的老品牌, 其价格贵了一倍, 另一款是国内一家新锐公司所生产的产品，这款产品价格便宜, 并且口碑也还不错, 在实验室里有人建议选择便宜的那一款, 还表示国产如今做得并不差, 老张并没有着急去拍板。
他进行了一回全面的对比测试, 采用同一批样本, 运用同样的引物探针, 通过同样的机器程序, 两款试剂盒分别各跑三块96孔板, 结果国产的那款在低拷贝样本里的检出率仅为82%, 进口的那款则是97%, 高拷贝样本中两者差异并不显著, 然而科研实验很多时候考量的就是低拷贝样本的检测能力。
老张最终挑选了进口的那一款, 他讲道, 进行科研PCR试剂盒的选型时, 不可以仅仅依照参数与价格来判断, 而是要关注在极端条件下的实际表现, 价格昂贵自有其高价的缘由, 价格便宜同理也有其便宜的原因, 关键在于弄清楚你的实验需求究竟倾向于哪一方面。
最终收获与心得
这个月月初的时候, 老张使用新挑选出来的科研PCR试剂盒再度跑了一回之前失败的样本。所有的扩增曲线都非常漂亮, 而且重复性也很好, 数据被提交给了合作方, 对方相当满意。老张讲, 现在他实验室里的同事都跟着他使用这款试剂盒, 实验的成功率显著提高了。
后续, 他于组会上进行了一回分享, 其标题乃是“科研PCR试剂盒怎么选——一个踩坑过来人的经验” , 他将自身的踩坑历程、选型规范、测试数据通通讲述了出来 , 他讲道: “咱们展开科研工作的人员 , 时间消耗所形成的成本相较于试剂盒的成本更为高昂 , 挑选到一款合适的试剂盒能规避两个月的弯路 , 这般的账无论怎样去计算都是极为划算的。”。
到最后, 老张跟我讲了一番言论, 所言内容, 予以我莫大启发, 令我深感其正确性: “科研PCR试剂盒并非简单的消耗品, 实则为实验成败的关键基石所在。你对于选型的认真程度如何, 实验数据便会以等额的认真程度来反馈于你。”。
要分享老张那些真实经历, 所以我写了这篇文章。他并非大专家, 只是个普普通通做实验技术的人员。然而他踩过的坑, 试过的错, 积累总结出的经验, 对于因科研 PCR 试剂盒选择型号而发愁的你而言，应该能给出一些有实际效用的参考。毕竟, 不会骗人的是实验数据, 选对试剂盒, 你的实验便已经成功了一大半。
