不久前的那两天, 老张忽然于微信之上寻觅我, 其语气之中携着一股兴奋状, 言道: “兄弟, 我终于是找寻到一款靠得住的甲基化特异性‘PCR试剂盒’了, 此次用于实验的数据美妙得不得了！”。
对我而言能持续五年保持相识关系的朋友老张, 于南方占据一个生物技术研发范畴主管职位, 所在公司主方向聚集于肿瘤早期筛查这一领域, 近两年里在这个业内空间, 存在一个名为“甲基化”的概念呈现出极为火爆的态势, 老张所在公司的老板, 已然将关注焦点锁定在了这一领域, 老张自去年下半年伊始, 就全身心投入到了甲基化特异性PCR试剂盒筛选这一项工作当中。
就是讲实话, 老张所做的这个活儿是比较难开展的。甲基化检测在听起来的时候显得高端大气上档次, 然而在实际真正落实到具体操作之时, 所出现的问题比预先设想的要多出许多。他们所在的公司先前使用过几款在市面上较为常见的试剂盒, 不是在灵敏度方面存在较大差距, 达不到应有的标准, 就是在特异性这个方面出现失误——明明是属于正常的样本, 却偏偏检测出阳性信号, 这种情况致使整个团队有那么一段时间陷入自我怀疑, 对自身能力产生极大的质疑。
甲基化特异性PCR试剂盒，到底难在哪？
在去年十月的一个晚上, 老张头一回跟我发表不满言论, 当时他才从实验室出来, 脸上耷拉着俩大黑眼圈, 说道 “你讲讲这甲基化特异性PCR试剂盒, 从原理方面讲不就是个经过改良后的PCR, 可是为啥在实际操作期间, 各种各样意想不到的麻烦事儿接二连三地冒出来? ”。
我向他询问究竟是怎样的具体问题, 他开始掰着手指头进行细数, 其一, 重亚硫酸盐转化效率呈现不稳定的状况, 在一些批次的DNA完成转化之后, 甲基化位点存在保护不全的情况, 所扩增出来的产物杂乱无章, 其二, 引物设计在表面上看似十分完美, 然而实际跑出来的熔解曲线却总是会出现非特异性峰；其三, 最为令人头疼的是, 批次之间的重复性欠佳, 同一批样本转换试剂盒之后结果就无法相互对应。
做甲基化检测的人, 很有可能都碰到过这些问题。甲基化特异性PCR试剂盒的关键核心, 仰仗重亚硫酸盐对待变处理, 使未甲基化的胞嘧啶转变成为尿嘧啶, 紧接着运用专门设计的引物, 用以辨别区分甲基化以及未甲基化的序列。听闻感觉容易, 但每一环节都对试剂盒的稳定性以及优化程度进行考核检验。老张所在的公司设在深圳, 于那段时期, 他差不多将周边所有供应商的样品都尝试了一遍, 然而最终没有一个能让他产生十足满意之感的。
从源头解决问题：关键参数怎么盯？
转折出现于今年一月, 老张参与完在上海举办的一个行业交流会后归来, 他整个人的状态显著不同了, 他一踏入家门便说道: “我此次见到了几位从事甲基化检测的行家, 他们为我指明了一条路途——别仅仅关注试剂盒的品牌, 而要看核心参数。”。
他掏出手机翻页给我看, 我问他什么参数, 他说: “第一个, 转化效率必须要大于等于百分之九十九点五, 要是低于这个数, 后面所有数据都毫无意义。第二个, 要看试剂盒对于低起始量DNA的适应情况, 我们大量的临床样本只有几十纳克, 有些试剂盒规定从一百纳克开始, 那完全不具备实用性。第三个, 要看它有没有内部质控体系, 像是带有一个人工甲基化对照, 如此每次跑板你都能清楚转化这一步是否出现问题。”。
是老张, 他依照这个思路又重新进行了一遍筛选工作, 此后他前往苏州一带那儿一家主要专做分子诊断原料这方面的公司, 在那儿取得了他们家最新的甲基化特定性PCR试剂盒这一样的器件。而这一回他并不像之前那次那样匆匆 rush 着去开展大样本的操作工作, 反而是先着手做了三件事, 其一是运用标准品来验证灵敏度, 其二是采用正常血细胞DNA去验证特异性，其三是再拿取一批有着已知结果的肿瘤组织样本开展相关的盲测工作。
有个结果, 使得老张略微感到有点意外, 在50纳克DNA起始量的这种条件当下, 一款试剂盒的转化效率很稳定地处于99.8%以上, 最让他心服口服的在于其特异性, 运行过一百多个正常样本, 不存在任何一个假阳性情况, 老张跟我讲称, 以前所使用的那几款, 总会有几个样本出现不稳定现象, 致使他每次看到阳性信号时都得进行反复验证, 而这一款则很好, 结果清晰干脆。
团队协作：从单打独斗到标准化流程
老张团队因有了趁手工具, 工作效率开始飙升, 然而试剂盒仅是第一步, 真正的挑战在于要将检测流程予以标准化。甲基化特异性PCR这项技术, 对操作细节极为敏感, 其中包括DNA提取质量、重亚硫酸盐处理时间、PCR循环参数, 随便哪一个环节出现些许纰漏, 结果便会出现偏差。
三月初时, 老张将团队召集在一起, 举行了一场会议。此前的他, 向来习惯于独自默默无闻地埋头苦干 , 这次他变得机灵聪慧起来 , 把曾经积累的经验予以分享。他要求每一位实验员, 使用同一型号的甲基化特异性PCR试剂盒 , 针对同一批样本展开操作 , 而后对结果实施比较核对。在首次进行比对时 , 竟出现了一种状况 , 有三个人所测出来的Ct值 , 相互之间相差了近乎两个循环。那么 , 问题究竟出在何处呢? 经过细致严谨地重新审查分析 , 发现存在这样的情况 , 有的人在进行重亚硫酸盐处理期间 , 没有做到严格地避免光线照射 , 有的人所使用的PCR仪 ，其温度校准出现了差错。
老张干脆弄了一套标准的操作流程, 每一步都定死了, 从DNA提取之后浓度的最低要求开始, 到转化试剂的使用时长, 再到PCR扩增的时候退火温度梯度。他还和试剂盒的厂家技术团队建了群, 碰到问题随时进行远程会诊。这套流程运行了一个月以后, 团队内部的重复性误差降低到了0.5个循环以内。老张讲: “以前以为甲基化检测是比较玄乎的东西, 现在发觉它实际上就是一门科学, 只要正确使用试剂盒、做好流程管控, 结果就是稳定的。”。
实战检验：从实验室到真实样本
是今年四月的一回实战, 真正使得老张对这款甲基化特异性PCR试剂盒笃定不移, 他们公司与广州某机构协作, 收取了一批肺癌高危人群的痰液样本, 而去开展甲基化标志物的筛查, 这批样本数量不多, 然而情形繁杂, 有的样本DNA浓度特别低, 有的样本保存时长超过两年, DNA降解得相当严重。
老张心里实际上没什么底, 他拿出先前用过的两款试剂盒拿来做对比, 其结果很残酷呀: 其中一款在低浓度样本当中直接扩增不出来, 另外一款虽然在低浓度状况下能够出结果, 然而阳性样本和阴性样本的区分度仅有1.5个Ct值, 根本没办法做出判断。而他当下正在使用的这款甲基化特异性PCR试剂盒, 即便在10纳克以下的DNA起始量这种情况下, 依旧能够稳定地区分甲基化与未甲基化的信号, 阳性样本和阴性样本的Ct值差异在4个循环以上。
那天晚上, 老张给我打电话，其声音之中带着那种久违了的轻松, 他说道: “兄弟, 我终于能够跟老板把任务给定好了。这批样本完成跑完之后, 其阳性检出率与金标准进行对比, 一致性是超过了95%的。并且整个流程, 从样本处理开始一直到出结果, 仅仅只用了六个小时。”。
回头再看：选对工具能省多少心？
老张现今所处的状态, 与半年之前呈现出巨大反差。往昔的时候, 他每日都沉浸于实验室之中忙于解决突发状况, 而如今他拥有了更为充沛的时间去深入思考全新的项目。上周, 我前往他所在的公司找寻他, 目睹他正与团队展开探讨, 思索着怎样将甲基化检测与NGS相互结合从而开展多靶点的筛查工作。他言道: “核心的问题已然得到解决, 后续的皆是额外增加的部分。”。
我询问他, 要是给那些做甲基化检测的其他同仁一条建议, 他会讲些什么, 老张思索了一番, 郑重地说道, 别在挑选试剂盒这事上节省费用, 甲基化特异性PCR试剂盒乃是你所有数据的基础, 一个性能平稳的试剂盒, 能够帮你省下起码一半的重复实验时间, 然而怎样判定是否稳定呢, 你得亲自去动手测量, 别仅仅看宣传页所示内容, 拿你们的真实样本, 跑三批数据, 瞧瞧批次之间的CV值, 瞅瞅特异性, 心里就会有底了。
他紧接着补充道, “另外还有一点, 千万别把技术支撑给忽视掉。那些优秀的厂家是会帮你去解决应用端方面的问题的, 就好比我所使用的那款试剂盒, 他们的技术团队甚至于帮我们修整优化了一版引物设计, 使得扩增效率提高了差不多10%。”。
老张的故事讲完了。从去年秋天的焦头烂额，到今年夏天的游刃有余，他走过了一条很多做甲基化检测的人都会走的路。甲基化特异性PCR试剂盒这个赛道，玩家越来越多，产品鱼龙混杂。真正能帮到你的，不是哪个牌子最响，而是哪个产品能在你的实验体系里稳定输出可靠数据。
倘若此刻你同样正为甲基化检测所具备的重复性以及灵敏度而发愁, 那就不妨如同老张那般, 自最根基的参数着手, 去寻觅一款能够经受住自身验证的试剂盒。毕竟, 当实验已然无法推进下去之际, 更换一种工具通常相比更换一种思路而言会更具成效。
