为什么这篇文章能帮你少走弯路
参与细胞实验相关工作的朋友们都清楚, 原代细胞向来是以非常“娇贵”而闻名的。特别是兔原代细胞这一类型, 从开始进行分离操作, 一直到后续的培养过程, 其中每一个步骤都仿佛如同在小心翼翼地行走于高空钢丝之上。我曾亲眼见证旁侧有一位朋友, 其开局是历经反复不断地遭遇失败, 最终才达成稳定产出合格结果状态, 他所亲身经历的种种状况几乎全面覆盖了你在整个过程中可能会碰到的全部各类坑点情形。而当前这篇文章将他迈出的每一步所遭遇的踩坑具体情况以及相应的问题解决办法都详尽地书写出来, 衷心期望能够助力你在面对同样的相关问题之际, 可以一次性就顺利通过不再出错。
朋友的工作背景
我有一位姓刘之名姓之人被大家称作老刘, 其于一家相关生物领域的公司里进行有关细胞生物学研究工作的研发部门充当细胞生物学研究员, 主要从事旨在涉及动物原代细胞模型建立以及实行药物筛选性质具体工作, 在今年刚刚度过新年之后, 他便接收到了一项作为紧急情况的工作任务——需要从新西兰大白兔的位于身体内部胸腔区域的心脏部位当中分离出心肌成纤维细胞成份用来作为针对于某类心脏纤维化情况的体外模型用途。
第一次尝试：差点被污染逼疯
老刘讲, 他头一回做兔原代细胞分离之际, 心里还算比较有谱，毕竟他于小鼠原代细胞方面经验多。然而真正开始操作才发觉, 兔子的组织块要比小鼠大好多, 消化耗时完全不匹配。他采用的是先前小鼠的那套0.25%胰酶消化办法, 结果消化没到二十分钟, 组织块就变得黏糊糊的, 在镜下观瞧, 细胞碎片一堆又一堆, 活细胞数目很少。
当时他还认为是胰酶活性不足, 于是又添加了些许浓度, 然而结果却更糟糕, 细胞直接发生了裂解。 那时, 有关那批兔原代细胞, 他连接种的动作都未曾进行, 就全部倒掉了。 这件事情促使他清楚地认识到, 不同物种的组织特性之间的差别实在太大, 根本不能以一概全而论之。
第二步调整：消化方案必须重新摸索
老刘在那段时期, 差不多天天都待在实验室里, 不停地翻阅各式各样的文献, 并且特意去请教了一位在大学做兔模型的师兄。这位师兄给了老刘一条关键的建议: 兔心肌组织的胶原含量很高, 仅仅使用单纯的胰酶是不行的, 必须要搭配二型胶原酶使用, 同时, 消化的时间需要控制在十分钟以内, 还要分多次去收集细胞悬液。
刘先生依据此方案再度进行了一番操作, 他将剪切成碎沫状的心肌组织块放置到填充有占比为0.1%的二型胶原酶以及占比为0.02%的胰酶的消化液内 , 于温度为37度的摇床那里实施消化作业 , 每隔五分钟便收集一回上清液 , 总共收集了四次。此次通过显微镜来观察 , 细胞呈现出的形态要美观许多 , 显得圆润且透亮 , 数量方面也较为可观。刘先生格外欢欣鼓舞 , 赶忙将其接种至培养瓶当中。
最麻烦的困境：细胞根本不贴壁
好不容易才高兴了两天, 麻烦事儿又冒出来了。在接种过后的二十四小时, 老刘去到显微镜所在之处查看, 竟然发现有大量细胞在培养液里处于悬浮状态, 压根就没附着在壁上。而那一些附着在壁上的细胞, 其形态也是扁扁的模样, 仿佛并没有完全展开。他尝试过把培养液换成新的, 还提高了血清的浓度, 然而这些办法都没有起到任何作用。
那个时候, 老刘压力巨大, 项目进度停滞不前, 领导每隔两天就询问一回。周末时, 他未曾休息, 独自在实验室查找资料, 最终发觉或许是培养皿的包被出了问题。兔原代心肌成纤维细胞对基质有着特殊要求, 普通培养瓶的TC处理表面不足, 必须在接种前用0.1%的明胶溶液包被至少一小时, 如此才能够促使细胞附着。
关键转折：包被和接种密度都要精细
老刘在那天晚上进行了明胶包被的尝试, 与此同时, 将接种密度从原本每平方厘米两万个提升到了四万个。次日清晨, 他进入实验室, 首要之事便是查看细胞。最终的结果使他松了一口气, 细胞贴壁率显著提高, 大部分细胞已然展开, 呈现为典型的长梭形, 并且开始开启分裂增殖的进程了。
那一张图片, 是他在实验室群里发出来的, 还配上文字“终于活了”。有一种感受存在着, 做过原代细胞的人他们都明白, 并非是钱方面的问题, 而是在时间上以及心血里投入了之后, 最终迎来了回报, 这样的情况是终于出现了。
后续的稳定培养：把握住换液节奏
细胞贴壁仅为第一步, 之后的培养却又有了新状况展现出来。老刘察觉到, 于培养的最初三天里, 细胞成长得出奇地慢, 并且极易飘起来。他起初依据常规以两天为周期来换一次液, 然而每次换液之后, 细胞的状态却一律会下降。
之后, 可他归纳得出, 兔的原代细胞身处早期培养时, 凭自身所分泌的细胞因子以及基质, 对于维持生长而言是相当关键的。频繁对其进行换液, 反倒会将这些有益的物质给冲洗掉了。于是, 他将做法改成在开始的三天里不换液, 在第四天的时候开始进行半量换液, 如此一来, 细胞的密度呈现出稳定增长的态势, 并且状态也始终维持得极为良好咯。
最后的收获：成功建立了稳定体系
老刘从首次失败开始, 一直到最终成功稳定培育出细胞, 这期间整整耗费了四周时间。当下, 他手中的兔原代心肌成纤维细胞已然能够稳定地传代至第三代, 并且细胞的活率均处于百分之九十以上。就在上周, 他运用这批细胞开展了转化生长因子刺激实验, 最终所呈现的结果十分出色, 进而公司领导在项目会上特意对他进行了表扬。
随后, 老刘与我交谈时说道, 进行兔原代细胞相关的工作这件事项, 最 crucial之处实际上便是三个要点: 其一是消化过程需温和, 其二是包被环节要达到位, 其三是替换液体不要过于频繁。每一个细微节点皆是凭借真切存在的失败而获取得的。
写在最后
要是你同样在开展兔原代细胞相关工作, 刚开始着手碰到难题那是相当正常现象, 不必急着对自己加以否定, 也不要盲目去套用其他物种的经验做法, 要多多查阅文献资料, 多多向有经验者进行请教, 将每一个环节都分解开来予以优化, 这个实验着实繁杂琐碎, 不过只要你把流程梳理清晰, 最终肯定是会有所收获的。
