老张第一次觉得“细胞株”这事儿没那么简单
老张, 是我的朋友, 在生物公司做研发有六年时间了, 一直自认为是“老江湖”。去年年初, 他接了一个新项目, 要用一种比较冷门的细胞株做功能验证。那时他觉得, 这就是常规操作, 传代、冻存、复苏这些, 闭着眼睛都能完成。
结果没想到，这成了他职业生涯里最折腾的一段日子。
细胞株复苏后状态不好怎么办
老张从液氮罐当中取出冻存管之际, 所有状况皆属正常。严肃依照SOP予以操作, 通过37度水浴进行快速解冻, 运用离心方式去除冻存液, 之后接种至培养瓶之内。然而间隔两日之后, 于显微镜下加以观察时, 细胞有的呈现为皱巴巴的状态, 有的则飘浮在培养基当中并不贴壁。
他跟我讲, 那几日他屡屡核查培养基, 屡屡核查血清, 屡屡核查培养箱的CO₂浓度, 各项参数俱皆无误, 然而细胞却就是不生长。而后他忆起往昔有个师兄提及过, 某些冷门细胞株对于冻存液里的DMSO格外敏感, 复苏之后需要更为温和的处理方法。
他尝试着去把离心的速度给降低下来, 将其从每秒1200转调整到每秒800转, 于此同时离心的时间也随之减少了一半。而后又重新复苏了一批, 状况相较于之前好了些许, 然而却依旧是还不能够达到进行实验所要求的状况。
细胞株传代后生长缓慢是什么原因
经过一个多星期的折腾, 老张终于成功将细胞株培育起来了。然而, 新的难题随即出现——在进行传代操作之后, 细胞的生长速度变得极为缓慢。从前所养成的那些常见的规范性参照细胞群落个体单元, 于执行传代操作之后耗时两三天便可生长至完全覆盖的状态, 但是此回这个具有明显差异辨识度的细胞群落个体单元, 历经五天的时间却才仅仅生长到六成的覆盖程度。
于是老张着手去查文献，而后翻论坛, 并且还询问了几个从事细胞实验的朋友, 其中有人提出疑问, 是不是消化过度致使胰酶将细胞膜上的蛋白全都破坏掉了呢；另外有人给出建议, 说或许该换一种培养基试试看, 有可能这个细胞株对于某种营养成分有着比较高的要求。
他尝试了各异的消化时间, 既有三分钟的, 又有一分钟的, 全都逐一试过了。更换成了更为高端的无血清培养基, 成本增加了一倍, 然而效果依旧不尽如人意。那段时期他整个人处于极为焦虑的状态, 项目进度停滞于此, 领导每日都在催促。
细胞株污染了该怎么处理
而这时候, 老张这边正焦头烂额呢, 幺蛾子出现。有一天早晨, 他去查看细胞, 看见了培养基里飘着一层物体, 往镜下仔细瞧, 是霉菌污染。那一批细胞全都不能用了标点符号。
老张讲那是自他做实验起始而来初回遭遇这般严重的污染, 他将培养箱、超净台、移液器统统再度进行灭菌以及消毒, 耗费了两三天的时长方才把环境给清理妥当, 然而问题降临了, 他所拥有的细胞株备份仅仅只剩下两管了, 要是再次产生污染, 项目就必须得重新从国外购置细胞株, 周期起码为一个月。
后来, 他跟我们进行复盘的时候, 总结出了这样一句话: 培养细胞株, 污染始终是一道无法回避的难关, 重点在于得具备预案。当时, 他就这么考虑着: 倘若存在一家可靠的供应商, 能够给予稳定的细胞株供应以及售后方面的支持, 也就用不着这般提心吊胆了。
细胞株鉴定结果不对怎么办
污染问题才刚被解决, 老张又撞上了一件可让所有从事细胞实验这一工作范畴的人都要为之头疼不已的事情, 那就是——细胞株鉴定的结果居然是不对的。他带着已然培养好的细胞去开展STR鉴定, 待结果得出之后, 拿去跟之前所购买的细胞株进行比对, 却发现存在好几个位点是对不上的。
于是乎, 如此这般一来问题可太严重了。假设, 是细胞株被其他细胞给污染了, 又假定在传代进程当中出现了交叉污染的状况, 那么, 此前所进行的全部实验结果可就得通通作废没法拿来用。老张赶忙去查实验室的细胞培养记录, 结果发现, 这个细胞株跟实验室里另外的一株细胞一同被放置在同一个培养箱当中, 极有可能是在操作之际手不经意抖了那么一下, 从而将两种细胞不知不觉地弄混淆了。
让他深切认识到的这件事, 是细胞株管理绝非小事。自那之后, 他给实验室定下一条规矩: 不同的细胞株得分开摆放, 操作顺序必需严格加以区分, 做完一个之后方才开启另一个。并且, 他特意购置了一个独立的培养箱用以培育这个项目所用到的细胞株。
细胞株冻存密度多少合适
历经之前那些折腾, 老张总算将这个细胞株养出了状态, 他着手思索冻存备份之事, 不能继续像往昔那般仅有两管冻存管了, 然而他又陷入了困惑, 此细胞株究竟冻存密度几何才适宜?
太稀薄了, 复苏之后难以生长起来；太稠密了, 又担忧冻存液当中的DMSO对细胞毒性过于大了。他查阅了相当多的资料, 还结合自身获得的经验, 最终做出决定采用这个细胞株处于对数生长期的细胞, 密度把控在每管大概 100 万个。在进行冻存期间, 他特地运用了程序降温盒, 以保证降温的速度是均匀的。
此次冻存, 成效显著。历经三个月后予以复苏, 细胞呈现出良好状态, 其贴壁率近乎达到95%。
细胞株实验结果重复性差怎么办
项目推进至关键时期, 老张再度陷入困境。他运用此细胞株开展了数次功能实验, 然而结果的重复性相当糟糕, 同样的处理操作下, 今日所获取的数据与明日的数据不相匹配。
他起始疑惑是不是细胞株自身的情况, 查阅了实验室的培养记载, 发觉最近几代细胞的生长速率的确存有变动, 部分细胞开始呈现空泡化, 他将细胞株送去开展支原体检测, 结果呈阳性。
细胞培养之中, 支原体污染属于最为隐蔽的问题, 肉眼无法看出, 镜下也并不显著, 然而它会对细胞的代谢、增殖以及信号通路产生影响, 致使实验结果出现偏差。老张赶忙将遭受污染的细胞全部予以处理, 重新复苏了备份的细胞株, 并且给实验室所有的培养基添加了抗支原体药物, 连续处理了两周时间。
老张现在怎么养细胞株
上个星期, 我跟老张一起吃饭, 他如今的状态变得轻松了很多。他讲, 经过长达大半年时间的一番折腾后, 他梳理出了一整套用于培养这个细胞株的标准操作流程, 从复苏这种操作开始, 再到进行传代操作, 接着到开展冻存操作, 直至最后的鉴定操作, 每一个步骤都有着清晰明确的SOP。
他朝着我讲述, 当下进行细胞株的培养, 最为关键的并非技术有多厉害, 而是得具备系统性的思维。他表明, 后来他更换了供应商, 寻觅到一家能够给出完整细胞株鉴定报告以及做好售后技术支撑的渠道, 省心了许多。他还给出建议, 每一个实验室都应当构建细胞株管理台账, 并定期进行鉴定以及支原体检测, 以此预防潜在的问题。
我因老张的这般经历而有所察觉, 那便是, 要培育好一批细胞株, 其背后实则依靠着无数细节的点滴汇聚。于复苏阶段的离心速度而言, 再到传代之际的消化时长, 从冻存密度一直到污染防控, 这当中的每一个环节, 都极有可能演变成决定实验成败走向的关键所在。倘若你同样处于培育细胞株的进程之中, 且遭遇类似的状况, 不妨去对照老张的那些踩坑经历, 瞧瞧是否在某一个细节之处有所疏漏。
毕竟，细胞株养好了，实验才有底气。
