去年秋天，我差点被一管PCR试剂搞丢了季度奖
朋友老周, 在苏州一家生物科技公司任职研发主管, 已工作快八年, 经手的PCR实验数量众多, 没有上千也达八百。去年九月, 公司承接一个紧急病原检测项目, 时间紧迫、任务繁重, 客户催促之急如火烧眉毛。彼时, 老周拍着胸脯告知老板, 三天即可出结果。
最终情况如何呢? 在第一轮进行扩增操作时, 所得到的熔解曲线呈现出不正常的状况, 其阈值信号处于飘忽不定的状态, 而内参基因的Ct值更是直接从18这个数值跳跃到了27。当时老周的脸色瞬间变绿, 随后在连夜的时间里对仪器、引物以及模板浓度展开排查工作, 一直折腾到凌晨三点, 最后才发现原来是那一批与PCR相关的试剂出现了故障——聚合酶的保真度不足, 并且还存在非特异性扩增所带来的干扰。
这事致使他遭受了极大损失, 还让他完全清楚了一件事情: PCR实验此物, 要是试剂挑选得不恰当, 先前做得所有准备工作统统都是徒劳无功。
PCR试剂到底该怎么选才能不踩雷
后来老周跟我讲, 在那次翻车以前, 他挑选试剂的标准着实挺粗糙, 哪个牌子便宜就买哪个, 哪个供货速度快便选哪个。然而那次教训使他发觉, PCR相关试剂的核心指标根本并非价格与速度, 而是稳定性、特异性以及灵敏度。
那次翻车的试剂, 被他拿去做对比, 接着发现那款产品的热启动修饰不够彻底, 进而导致在低温阶段有非特异性产物生成。真正优质的PCR试剂, 热启动酶的修饰机制必定是化学修饰或者抗体修饰, 而这能直接决定你扩增的特异性。
而且他还提醒我要留意一点, 就是当前在市面上存在着一些厂家, 为了去压缩成本，将Taq酶的浓度标注得虚高, 然而其实际活性根本就无法达到标签所标注的值。老周随后更换了另一个供应商提供的试剂, 针对同样的模板, 以及同样的引物, Ct值稳定处于20.5至21.2之间, 波动幅度不到0.5个循环, 这样才算是真正把实验给做稳当了。
供应商的靠谱程度比价格重要一百倍
那次翻车之后, 老周花了一个月时间重新筛选供应商, 他是这样操作的：首先, 直接去找那些身处于行业里沉淀了五年以上时长的生产厂家，避开那些仅仅是做贸易倒手的小公司。其次, 要求供应商提供近三个批次的质控报告, 每一份都要详尽到热启动酶的比活性数据、DNA污染残留的检测结果、批次间的Ct值标准差。
去年十一月份时, 他与东莞一家专营PCR相关试剂的厂家取得联系, 随后, 对方径直寄来五套不同批次的样品, 且附带了完整的验证数据。老周将其拿回后, 进行了三轮独立测试, 每一轮测试的重复性都颇为良好。他告知我, 真正具有可靠性的供应商敢于把数据展示出来供你查看, 而那些遮遮掩掩的供应商, 十有八九是自己心里没底。
值得注意的还有一件事，在挑选供应商之际, 不要仅仅着眼于销售人员的口头应允, 老周所采取的方式是直接询问技术支撑的背景情况, 他当下的供应商那里配备了三名拥有硕士学历的应用工程师, 当客户遭遇扩增效率不达标或者出现非特异性条带的状况时, 能够在半小时之内给出排查方案, 这样的服务能力, 才是达成长期合作的保障。
不同实验场景对PCR试剂的挑剔程度差很多
当前管着三个项目组的老周, 每个项目组的实验场景差异明显, 在PCR相关试剂方面, 各个组的要求全然不同。
进行基因分型的那一组, 重点关注试剂对于等位基因的特异性扩增能力, 哪怕存在有些许的偏倚, 都将会致使分型结果的判读出现错误的几率飙升。配备给他们的是老周所提供的高分辨熔解曲线专用预混液, 此预混液在GC含量较高的区域同样能够顺利实现扩增, 绝对不会出现脱靶的状况呈现产生。
做病原微生物检测的那一组, 最为惧怕的是抑制剂产生干扰以及低拷贝模板出现漏检情况。老周在这边所使用的试剂乃是添加了UDG防污染系统的, 其能够有效地消除由气溶胶所导致的假阳性现象。他在今年三月份这个时间, 运用这批试剂开展了一次灵敏度梯度实验, 在每反应1拷贝那般的模板浓度状况下, 依旧能够稳定地扩出Ct值处于35以下的信号, 这样的表现使得他内心彻底安稳了。
在进行基因表达定量的分组中, 对于反转录的效率以及线性动态范围有着较高的要求。老周所选择的是含有优化配方的SYBR Green预混液 , 标准曲线在6个数量级的扩增倍数范围之内, 都能够保持相关性R²值在0.998以上。他表示, 定量实验最害怕的情况就是高丰度模板扩增到平台期之后信号产生失真 , 而好的试剂能够将这个窗口再拉大一个循环。
PCR试剂的储存和使用细节才是翻车的隐形杀手
老周跟我讲述过一个细节, 他曾有一个同事, 买回来一箱进口的PCR试剂, 放置在冰箱里三个月都没有用完, 然而最后一次使用的时候却发觉扩增效率呈断崖式下降。后来经过查询, 原来是反复冻融的次数过多, 聚合酶的活性结构遭到了破坏。PCR相关试剂当中最惧怕的就是热启动酶和逆转录酶, 这两种酶对于冻融格外敏感, 每多融一次, 活性便往下掉一截。
老周所采取的当下做法是, 在从大包装买回来之后, 即刻就进行分装成小管, 每一个小管仅仅只能够满足一次使用之需求, 一旦用完立马将其扔掉, 绝对不会予以回收利用。再者, 他特意在冰箱门上张贴了标签, 用于注明每种试剂被分装的日期以及有效期, 要是超过三个月界限的便直接作报废处理, 他一点都不会对此心疼那部分钱财, 原因在于废弃一次实验所产生的成本远远超过试剂本身所付出的成本。
此外他向我发出提醒, PCR试剂于运输期间倘若保温举措不妥当, 同样有可能出现状况。他当下的供应商所采用的是冷链配送方式, 借助泡沫箱再加上冰袋, 全程有着温度记录仪予以跟踪, 货物抵达之后在第一时间测量温度, 超出8度的全部予以拒收。这种习惯他持续坚持了半年时间, 此后再也未曾出现过因储存方面的问题而引发的实验事故。
PCR试剂行业的坑和门道，老周现在全摸清了
今年五月之际, 老周参与了一场于行业范畴内举办的技术交流会议, 与数位同行展开交流探讨, 随后察觉到众人皆曾遭遇过相似的困境。有一位从事医疗检测工作的友人表明, 他往昔曾被某一代理商蛊惑, 进而购置了一批宣称是进口原装品的PCR试剂, 然而最终所扩增出的熔解曲线与标准品相较, 整整相差了两度, 后续送去检验方才发觉乃是国产贴牌的产品。
老周归纳出了一种选品三步的方法: 其一, 查看资质。正规的PCR试剂制造厂家必定得具备医疗器械注册证又或者是一类体外诊断试剂备案, 要是没有这两个证件, 那就直接淘汰。其二, 审视数据。向供应商索要起码三个批次的产品验证报告, 其中涵盖灵敏度、特异性、重复性、批间差, 每一项都得有确切的数值, 绝不可是“符合标准”这种含混的表述。其三, 瞧一瞧应用案例。询问供应商在同类实验场景当中有没有成功的客户案例, 最好是能够获取到客户反馈或者发表的文章引用。
就是按照这三步筛出来的, 是他现在的供应商。那家厂在PCR相关试剂领域做了六年, 这家厂为企业本身有具备且拥有着自己的生产基地, 同时还带有研发实验室。每一批产品在出厂之前都要经过三重质控, 一重是原料质检, 一重是中间体质检, 成品质检作为最后一重其重要性亦不容。忽视于四月份之时, 老周选用他们的试剂做了一组对比实验。与国际头部品牌的产品进行比较, 在相同模板浓度的情况之下, Ct值出现的差异在0.3个循环以内, 扩增曲线的指数期斜率几乎呈现出重合状态, 几乎没有明显差异。他表示称, 这样的结果意味着, 用国产试剂完全能够替代进口, 而关键之处在于价格仅仅只有进口的三分之一。
实验稳定的底气来自试剂的长期一致性
不是一次实验做得多么漂亮, 这并非老周当下最为看重的指标, 而是半年、一年过去后, 试剂批次之间的差异究竟能不能被控制在可以接受的范围中, 此才是老周现在最为看重的指标。他每个月都会开展一次质控实验, 所使用的是同一个标准品, 以此来详细记录Ct值的波动范围。从去年十二月直至当下时刻, 他所运用的那款PCR预混液的Ct值标准差始终维持在0.4以内, 这般所得的数据让他对于后续的项目推进满怀信心。
他给我核算了一回账目, 以往使用不稳定的试剂之际, 平均每开展五组实验便会有一组需要进行复测, 复测一回起码耗费两个人力以及半天的时间。改用稳定试剂之后, 复测率降低到了不足百分之二, 这一整年下来所节省的时间成本以及管理成本, 远远高于试剂自身的差价。
老周讲, 做分子实验这事儿, 好多时候并非是同样本较劲儿, 而是在跟试剂较劲儿。你挑选的同PCR有关的试剂越具稳定性, 你便会拥有越多精力去留意实验设计以及结果解读, 而非每日都在排查问题、补做实验。他当下所在的团队, 工作效率相较于去年起码提升了三分之一, 大家变得轻松了, 项目进度顺带也加快了。
