上个周末, 老张于微信里面给我发出了一张截图, 那是他刚刚签署下来的一份采购合同, 金额并非很大, 仅仅也就是两万出头而已, 然而他配上了一个包含“终于”意思的表情。我回复了一句话: “此次难道没有遭遇失败的情况吗? ”他发送了一个类似于抱拳的表情, 说道: “已经稳妥了。”。
老张是朋友, 我认识他五年了, 他在二线城市的高校里做实验员, 从事分子生物学方向, 实验室面积不大, 不过课题数量众多, 特别是近两年, 他们团队手握两个省自然基金项目。在课题组里, 老张主要负责样本前处理以及PCR检测事宜, 也就是说, 要帮老板得出数据, 填充论文里的图表。
但就是这看起来简单的PCR检测, 在过去长达大半年的时间里，险些将他逼到疯狂的境地。
实验总是跑不顺，是哪里出了问题
老张所在的实验室, 所使用的是常规的那种荧光定量PCR平台, 之前一直以来都在使用某进口品牌的试剂盒, 虽说价格昂贵, 然而好在具备稳定性。去年年末的时候, 学校方面预算出现收紧情况, 采购科提出要求, 要将所有试剂类耗材朝着国产方向去挤压, 老张所在的课题组, 被削减掉了将近三成的耗材预算。
那会儿他没怎么放在心上, 心里琢磨着那个PCR, 觉得不过就是模板、引物、酶以及缓冲液罢了, 并且国产试剂盒在这两年发展相当迅速, 价格便宜超过一半, 那就换了呗。
结果从今年一月份开始，噩梦就来了。
当时, 一个新型项目落入他手上, 这项目是基因分型, 其用到的样本, 乃是从医院合作方那儿送来的, 数量超过两百例, 为临床组织标本。老张依据新试剂盒的手册, 一步一步开展操作, 先提取核酸, 而后配制体系, 再拿去上机扩增。做出来的曲线, 歪歪扭扭, 很不规则, 熔解曲线的峰值发生飘移, 幅度不止一个温度单位, 三组重复的一致性, 差到了极点, 十分离谱。
那段时间, 老张是天天都待在实验台前, 先是去换退火温度, 接着又来调镁离子浓度, 甚至还换了不同批次的引物, 就这么折腾了将近两周时间, 可数据依旧是没法使用。随后他跑去询问试剂盒厂家的技术支撑, 对方回复称“有可能模板质量存在问题”, 要求他重新去提取核酸。老张心里窝着一股火, 然而又没有别的办法, 只能照着去做。
PCR试剂盒为什么总出现非特异性扩增
核酸重新提取之后, 老张针对每个样本, 都对其浓度以及纯度进行了一次测量, A260与A280的比值全部处于1.9至2.1这个范围之内, A260和A230的比值也全都高于2.0, 按理说模板质量是符合要求的。他把样本送往合作实验室, 使用进口试剂盒进行了一次检测, 结果数据非常漂亮。很明显, 问题就出在试剂盒本身。
老张跟我讲, 他最为闷闷不乐的并非是实验遭遇失败，而是不清楚问题究竟出在哪个具体的环节。PCR试剂盒看上去貌似简单, 然而其中各组分只要存在一个细微之处不合适, 诸如聚合酶的保真程度不够高, 又或者缓冲液里头离子调配与目标模板GC含量不相匹配, 便会致使出现非特异性扩增呢。
他尝试着将原厂试剂盒当中的酶单独取出来, 去替换成另外别的品牌的酶, 然而结果却是曲线好了些许, 可是重复性依旧是差的。他在这个时候才察觉到, 试剂盒是属于一个完成的体系, 酶、引物、缓冲液、dNTPs它们之间是彼此相互配合的, 要是随意更换其中一个组分, 那么体系就会失衡了。
在那段日子里, 老张体重减轻了将近十斤, 与此同时, 组内的研究生也一同跟着投入加班行列。老板多次进行催促, 声称如果再无法拿出数据, 项目中期汇报这事就要失败了。
科研PCR试剂盒怎么选才能不踩坑
三月份之际, 老张决然摒弃了那款价格低廉的国产试剂盒, 转而着手重新挑选产品品类。他罗列了一份清单, 将市场上占据主流地位的科研PCR试剂盒品牌逐个进行了查询, 着重留意几个指标: 扩增时的灵敏度、特异性、重复性, 以及技术支撑方面的专业程度。
那时, 他与我通完电话, 表明自己挑选试剂盒, 其标准实则特别简单, 仅仅是“稳”。对于价格相差几百块, 他并不大在乎, 然而却难以忍受每一批次的实验都得自起始处便去调整条件。他讲道, 从事科研工作的人都清楚, 实验具备可重复性才是最为关键的, 要是一个试剂盒无法达成批次之间的稳定, 那么即便价格再低廉, 也纯粹是在白白耗费金钱以及时间。
然而老张是存在顾虑的, 他先前使用过的那款进口试剂盒的确是稳定的, 可是价格就摆在那里, 要是全都采购进口的, 对于老板以及采购科而言都是不好去交代的, 他是务必要寻觅一个价格处于适中状态、然而性能却接近于进口水平的国产或者合资品牌的。
他开展了一次小范围的测评, 选取了五个品牌的试剂盒, 采用同一个模板, 运用同一批引物, 于同一个热循环仪上进行了六组平行实验。测评结果揭晓后, 有一家企业的产品展现出极为突出的表现, 其Ct值波动范围被控制在0.3以内, 熔解曲线峰形呈现出锐利的态势, 并且非特异性扩增带几乎不存在。
老张特意去查了查这家企业的背景, 发觉他们同一些国内一线机构存在长期的研发合作关系, 其生产工艺以及质控标准均参照了国际大厂的做法。他怀揣着试试看的心理, 先购入两盒小包装的拿来做验证。
PCR试剂盒灵敏度不够怎么办
处于验证阶段之时, 老张碰到了新的问题, 他所采用的样本类型颇为特殊, 乃是经由福尔马林固定好的石蜡包埋组织, 此等样本的核酸降解程度偏高, 浓度偏低, 对于试剂盒的灵敏度有着极高的要求。
他先是使用新试剂盒去跑了一组稀释梯度, 该稀释梯度是从10纳克每微升开始, 一直持续稀释到0.1纳克每微升, 并且每个梯度设置了三个复孔。结果使得他感到略微有点意外, 在处于0.5纳克以下的低浓度区间当中, 新试剂盒依旧能够稳定地检出目标片段, 而且其扩增曲线起峰表现正常, 并没有出现“拖尾”或者“翘尾”的现象。
老张跟我讲过, 他先前使用那款价格低廉的国产试剂盒时, 1纳克以下的模板基本上就“找不到踪迹”了, 要么是不出现峰, 要么是出现峰之后曲线呈现出锯齿状, 完全没有办法进行分析。然而这款新的试剂盒在低浓度状况下的表现, 基本上与进口产品相当了。
他在之后知晓了, 这是源于试剂盒当中的DNA聚合酶历经了定向进化改造, 其对于低丰度模板的延伸效率更为高些, 与此同时试剂盒里加添了一种特殊的稳定剂, 此稳定剂能够降低模板里残留的甲醛等抑制物对扩增所产生的干扰。这些具体细节, 说明书之上不会予以书写, 然而实际使用起来差别便是如此之大。
早在四月初始时期当口那儿, 老张借助崭新的试剂盒, 针对先前的那一批数量多达两百多个的样本, 全部再次进行了一遍操作跑检, 而后数据一次性顺利符合通过要求, 老板看过这份结果以后, 仅仅说出了“不错”这两个字眼, 对于老张而言呀, 这两个字所蕴含的价值, 要比任何形式的奖励都显得更为珍贵值得。
科研PCR试剂盒哪家好，关键看这三点
后来, 老张跟我一起复盘了这次踩坑的经历, 总结出了三件事。其一, 不要迷信低价格。在PCR试剂盒这个品类中, 成本是透明的, 倘若价格低到离谱, 大概率是在某些关键组分上做了妥协, 比如酶的活性单位偏低, dNTPs纯度不够, 或者缓冲液配方被过度简化。做科研并非是为了省钱, 而是为了出数据, 省出来的钱要是换不回可重复的实验结果, 那便是最大的浪费。
势必要留意技术所支撑的响应速度以及质量。老张于踩坑这段时期, 向好几个品牌拨打了电话, 存在这样的情况, 有的客服, 根本就听不懂他所询问的内容到底是什么, 仅仅会机械性地去读说明书, 还有的, 甚至要求他自己去上网查找文献。然而, 最终他所选定的那家企业, 其技术专员在电话当中与他交谈了差不多四十分钟, 从模板GC含量开始, 一直到退火时间设置, 逐条逐款地帮他去进行分析, 还主动提出来要寄送试用装。像这种服务的态度, 于国产试剂盒品牌范围之内确实是不多见的。
尽可能不要在中途去更换那已经验证过的试剂盒体系。老张讲, 要是预算并非完全承受不住, 他是不会再轻易去更换试剂盒的。由于每更换一回, 都得重新开展方法学验证, 重新摸索条件, 重新撰写SOP, 时间成本要远比试剂盒本身的差价高很多。
上一个月期间, 老张所在的课题组再度申请了一项全新的课题, 其方向是关涉肿瘤伴随诊断相关的基因突变检测, 他毫无迟疑地持续采用了那款试剂盒, 而且还主动向隔壁的课题组进行推荐, 让好几个师弟师妹去试用。使用他的话语来表述: “已经踩过的坑；绝不应当再次让兄弟去踩。”。
如今, 老张每日于实验室裹忙得分身乏术, 然而其焦虑之感却显著削减不少。他对我讲起, 从事实验恰似驾车, 路况以及天气难以掌控, 可是倘若车足够稳当, 内心便有底略。关于科研PCR试剂盒此一事, 他已全然领悟透彻。
