我那个天天泡实验室的朋友，最近终于熬出头了
假使你在开展肿瘤细胞株相关实验, 老是停滞在重复性严重欠佳、数据呈现出飘忽难以稳定的阶段之中, 那么我这位朋友的经历, 建议你花费五分钟的时间将其看完。他所遭遇过的挫折, 跟你当下所碰到的状况, 几乎是完全相同的情形呀。
我知晓阿峰已达三年之久, 他身为中科院上海生命科学研究院之一名助理研究员, 主要钻研肿瘤细胞株的体外药物筛选。每日的日常便是在培养箱与超净台之间往复奔走, 有时还得对着显微镜发愁。去年冬天, 他所负责的一个项目步入了关键阶段, 老板要求在三个月内达成一批肿瘤细胞株的耐药性验证实验。
肿瘤细胞株传代后状态变差，怎么办
阿峰所使用的, 乃是一株自 ATCC 购置而来的肺癌细胞株 A549, 先前一直将其饲养得颇为良好。然而自十月份起始, 每一次进行传代之后, 细胞的生长速度显著地变慢了, 贴壁率同样下降了近乎 40%。他尝试了更换培养基, 调整血清浓度, 甚至于把培养箱的温度再次校准了一回, 可均未出现明显的改善。
阿峰后来跟我喝酒时说起这个, 还是一脸苦笑。“那段时间我每天进实验室, 第一件事就是看细胞, ”他说, “但每次看到的, 都是死细胞和碎片。”他试过增加消化时间, 试过换成更低代次的细胞株, 甚至还跟隔壁实验室借了培养基, 可问题依然存在。
肿瘤细胞株污染了，怎么判断
更麻烦的情况出现了, 他遭遇了污染方面的问题, 一次时机下, 他于镜下观察到, 培养基之中存在一些细小的呈现运动状态的黑色颗粒, 起初的时候, 他把那些当作是细胞碎片, 然而后续颗粒数量越来越多, 甚至连培养液的颜色都发生了改变, 这时他才意识到, 此种状况极有可能是支原体污染。
阿峰说, 当时他脑子嗡的一下, 因为那一拨细胞已然养了两个月之久, 要是被污染了, 先前的数据就全都报废了, 他赶忙运用PCR试剂盒加以检测, 结果确实呈阳性, 那两周时间里, 他几乎将实验室的消毒流程自始至终改动了一遍, 还特意购置了支原体清除试剂, 这才算是把控住了局面。
肿瘤细胞株实验重复性差，数据不稳，怎么解决
好不容易把污染相关问题给解决掉了, 然而新的棘手麻烦又随之而来了。自今年一月份起始, 阿峰察觉到同样的实验方案, 所做出的IC50值呈现出非常大的波动状况。周一开展的实验, 到了周五再次去做一遍, 其结果竟然能够相差出一倍之多。他对此产生怀疑, 觉得是肿瘤细胞株自身存在问题, 可是在更换了新批次的细胞之后, 波动情形依旧是存在着的。
阿峰说, 当时他自身已然是有那么一点儿处于崩溃的状态了, 老板催促得十分紧迫, 而用于的相关数据却又实在拿不出手来。随后他着手开始查阅文献, 发觉好多同行都遭遇过相似的问题, 最终将一个关键要点给锁定了, 那就是肿瘤细胞株在历经长期培养的进程当中, 基因表达以及相关表型会出现漂移的状况, 这会直接致使实验最终的结果呈现出不稳定的态势。
肿瘤细胞株如何保证基因型稳定
经过两周的时间, 阿峰就实验室现有的细胞株, 全都进行了STR鉴定以及基因表达谱分析, 结果发现, 那株A549细胞存在部分基因表达量的确实现象和变化, 特别是与药物代谢相关的几个十分关键的基因。于是, 他毅然决然地将这批细胞放弃, 重新从早期冻存的种子库内, 复苏了全新的细胞。
与此同时, 他严格得对细胞的使用代数进行了限制, 作出规定, 传代次数不能超过15代, 一旦达到这个次数就必须重新启用被冻存着的细胞。另外, 他还为每个实验都添加了内参对照, 以此来保证每次实验的基准线是保持一致的。
肿瘤细胞株数据突然异常，可能是什么原因
三月份之际, 阿峰再一次碰到了一个令他琢磨许久都弄不明白的问题, 他所开展的一组耐药性诱导实验里, 细胞株在前面四周始终保持稳定状态, 然而到了第五周的时候, 耐药指数一下子急剧上升, 远远地超出了预期数值, 他再三去检查实验步骤, 可都没有找寻到明显差错。
阿峰说, 当时他觉得或许是细胞自身变异了, 然而后来发觉是自己所使用的诱导药物的浓度梯度设置得并不是很合理。他把浓度递增的幅度做了调整, 将原来每次提升百分之二十改为百分之十, 于是耐药性的上升就变得平稳了。后来他才弄明白, 肿瘤细胞株对药物的适应是循序渐进的, 浓度变化过快会致使细胞群体出现异常筛选。
肿瘤细胞株实验质量控制的关键环节
历经这三个月的一番折腾之后, 阿峰归纳出了一套属于他自己的实验质控流程。其一，是每次去进行实验之前, 都必然得去做细胞活力检测以及支原体检测, 这可是底线所在。其二, 是每个实验起码要设置三个生物学重复还有两个技术重复, 以此来保证数据具统计学意义。最后, 是要定期针对肿瘤细胞株开展表型验证, 像是去做一次细胞周期分析或者克隆形成实验, 以确保细胞并没有出现意料之外的变化。
“此刻我养细胞, 恰似养孩子那般谨慎。”阿峰含着笑讲道, 他的项目于四月底顺遂杀青, 数据被老板径直拿去投了一篇二区SCI, 上周他还跟我讲, 那套质控流程已被他们实验室写入SOP, 其他人也在运用。
要是你此刻也正遭受着肿瘤 细胞株的实验难题的缠扰, 那不妨试着从阿峰所经历的教训当中寻觅些灵感。好多时候, 实情并非是你的实验设计存在着问题, 而是细胞自身的状态或者实验流程里的某一个细节出现了差错。多投入些时间在细胞的质量把控方面, 后续的进展将会顺畅许多。
