文章正文
这篇文章并非讲空话, 而是单单讲述一个朋友踩过的坑, 再讲述其爬出来的路。倘若你正为ELISA检测试剂盒的选择头疼, 又为其使用头疼, 还为结果不稳定头疼, 那么这篇文章是值得你读完的。
我结识了一位从事生物医药研发工作的友人, 此人姓张, 称其为老张, 他于一家第三方检测机构任职达六年之久。他的主要业务范畴是投身于免疫学相关的那些检测项目, 而ELISA试剂盒在他的日常工作里几乎成为每日都必定会接触到的物品。前段时间他承揽对接了一个崭新的项目, 乃是客方规定去测定检测血清样本之中的某一个细胞因子, 该样本数量庞大、时间周期紧迫、对数据严苛程度很是高, 最终的结果是他险些遭遇失败。
ELISA检测试剂盒到底该怎么选？
较早时候老张并未特别将其当作重要之事, 在前此阶段他使用过好些不同品牌的ELISA试剂盒, 内心认为大概也就是进行包被操作、添加样品、使之孵育以及进行显色这般几个步骤而已。随后他随意地从库房当中取了一款曾经使用过的试剂盒, 并且没有认真查看批号以及有效期, 便径直开始操作了。
第一批数据出来了, 结果标准曲线的R²值仅仅为0.92, 复孔之间的CV值比15%还要高, 有的样本甚至连信号都测不出来。老张当时一下子就懵掉了, 他做实验已经六年了, 从来都没有出现过如此严重的失误。
他着手对问题展开排查, 第一步是查看试剂盒自身, 他颇为细致地将说明书翻阅了一回, 觅得这款试剂盒的检测范围与他所要检测的样本浓度范围全然不契合, 他所要检测的样本浓度差不多处于50至500 pg/mL之间, 然而这款试剂盒的检测下限是100 pg/mL, 上限是2000 pg/mL, 其敏感度着实不足。
试剂盒的检测范围匹配吗？
这是诸多新手极易忽视的内容。老张随后对我讲, 挑选 ELISA 检测试剂盒时, 首要步骤并非查看品牌, 而是留意检测范围。你暂且要确切弄明白自身样本浓度大致处于何种区间位置, 接着挑选出一个检测范围能够涵盖该区间的试剂盒。要是样本浓度过度靠近检测下限, 数据特容易偏低乃至无法测出来；要是过于靠近上限, 容易产生“钩状效应”, 信号反倒会下降。
这次他选用的试剂盒, 其检测下限设定为了 100 pg/mL , 然而他所拥有的样本之中, 存在着一部分浓度仅仅处在 50 - 60 pg/mL 的范围, 自然而然地就没办法检测出来。
为什么同一个试剂盒两次结果不一样？
老张更换了一款检测范围恰当契合的试剂盒, 再度开展了一批样本的操作。此次标准曲线绘制得甚为出色良好圆满如意, 可以说近乎完美, R²值已然达到了0.99达到了一个相当高的水准, 复孔CV也如愿顺利成功地控制在了10%以内。他因此觉得认为觉得以为问题已然得到了解决处理解决办法, 进而继而于是就把第一批样本重新再度再次进行了测量检测测定一遍。
最终, 第二批数据与第一批数据不相符合, 针对同一批样本, 前后两次所测出来的数值相差超过了30%, 老张再度开始头疼起来。
他对每一个有可能的缘由都进行了查验, 诸如那份样本会不会出现了反复冻融的有关情况? 那个孵育时间有没有被严格地予以把控? 那场洗板行动有没有达成洗得洁净的效果? 最终他觉察到, 那问题是出在了批间差这个方面上。
批间差大怎么办？
两批试剂盒, 老张正在使用, 品牌是一样的, 然而批号却不一样。他查找了厂家所提供的批间差数据, 结果发现CV超过了12%, 在ELISA试剂盒当中, 这样的数值算是比较大的了。若有项目需要长期进行监测, 或者有项目需要对前后数据予以对比, 批间差过大的话, 会致使数据失去可比性。
以后他换了那种批间差被控制在8%以内的品牌, 接着才把问题给解决了。他讲, 要是你做的是横向对比或者时间序列的检测, 那可一定要留意试剂盒的批间差, 尽可能一次性采购足量的同一批次试剂盒, 防止频繁更换批号。
ELISA检测试剂盒的保存条件有多重要？
得以解决批间差这一问题之后, 老张暗自认为所有事情都已圆满妥当。然而, 到了第三周的时候, 数据却再次出现问题。此次出现问题的情况是, 一些低浓度样本的信号呈现出异常偏高的态势, 仿佛是遭受了污染。
他一次次地反复去排查操作流程, 并未察觉到有明显的操作方面的失误, 最终呢他发现, 问题是出在了试剂盒的保存这件事情上面。
他身处的实验室, 冰箱温度存有不稳定情形, 常有人员开关门, 致使冰箱温度出现较大波动。ELISA试剂盒里的抗体、酶结合物等成分, 对温度异常敏感, 一再经历冻融或者长时间置于不稳定温度状况下, 会致使抗体活性降低或者非特异性结合情形增多。
试剂盒怎么保存才稳定？
老张后来特意去买了一个小型冰箱, 专门用来放置试剂盒, 其温度设定处于2至8℃的范围中, 并且尽可能地去减少开门发生的次数。他还将尚未用完的试剂盒分解成小份, 以此来避免出现反复冻融的情况。在做了这些调整以后, 数据就变得稳定了许多句号。
他讲, 好多实验室仅仅留意操作流程, 却遗漏了试剂盒自身的保存条件。实际上, ELISA检测试剂盒的稳定性在很大程度上是由前期的保存管理决定的。要是你发觉数据时高时低, 先别急于怀疑操作, 去检查一下冰箱温度曲线。
样本前处理对检测结果影响有多大？
一个月之后, 老张承接了一个新项目, 这个项目检测的是小鼠组织匀浆里的某个炎症因子。他依照常规方法对样本进行处理, 然而测出来的浓度极低, 几乎快要接近检测下限。他怀疑样本自身的浓度原本就不高, 可是客户的预期值应当不低。
他查阅了文献, 发觉这种针对组织匀浆样本的前处理方式颇具讲究之处。倘若采用普通的裂解液去提取, 极有可能性地带走一部分目标蛋白, 进而致使检测浓度处于偏低的状态。他更换了一种含有特定蛋白酶抑制剂的裂解液, 并且对匀浆的时间以及温度进行了优化, 在重新提取之后, 浓度提高了三倍有余。
样本前处理要注意什么？
张老者归纳表明, ELISA检测试剂盒的说明书当中通常会讲述样本前处理的要求, 然而多数情形下讲述得颇为简略。要是你所采用的是血清或者血浆, 困难并不大, 可是要是属于组织匀浆、细胞裂解液、尿液或者唾液这类繁杂样本, 前处理的方式直接对检测结果起决定作用。
之前做之前, 他建议先去查一下文献, 看看同行针对同类样本采用了怎么样的处理方法, 最好去做一下预实验, 以此验证不同的前处理方式对于检测结果会产生何种影响, 千万别拿到试剂盒后就立刻开始操作, 而是要把时间充分花费在前处理的优化工作上, 如此后面开展才能够顺利许多。
实验过程中最常见的技术性错误有哪些？
最近几年, 老张所目睹的ELISA实验出现失败的实例, 十个当中有八个是源于技术方面存在的差错。他讲道, 最为常见的几个问题涵盖:
洗板的时候没有彻底洗净, 这一步其看起来好像挺简单的, 然而好多人因为想要贪图省事, 洗的次数达不到要求, 或者每一个孔所添加的洗液量并不均匀, 最终致使非特异性结合的情况在增加, 其背景信号显得偏高。
孵育时长不准确, 有些人因要赶时间, 把孵育时间给缩短了, 还有些人因想追求更强信号, 将孵育时间予以延长, 此两种做法均会致使标准曲线失真。
进行加样操作时会出现误差情况, 特别是通过手动方式来加样, 要是枪头未进行更换或者加样时速度并非保持一致, 那么就极易致使复孔彼此呈现出较大的差异。
怎么避免技术性错误？
老张想出的解决办法极为简单, 那便是流程标准化, 他为实验室订制了一套SOP, 将每一步的操作时间、温度以及加样量都清晰写明, 并定期开展人员培训, 他还提议使用多道移液器来进行加样, 以此减少手动操作所引起的误差。
要是你察觉到自身的ELISA实验数据处于不稳定的状态, 那么建议你首先去回顾一番操作流程, 查看一下是不是存在某一步骤操作得不够规范的情况。许多问题并非是源自试剂盒的问题, 而是属于操作方面的问题。
不同品牌ELISA检测试剂盒怎么对比？
此刻手握一个固定试剂盒品牌库的老张, 在每次开展新项目之前, 会先去对比几个品牌的产品, 他着重看的几个指标是: 检测范围, 灵敏度, 特异性, 批间差以及价格。
他讲道, 价钱并非最为关键的, 要是数据缺乏可靠性, 即便再低廉那也属于一种浪费。他更加注重灵敏程度与特异性质,这两项会直接对能否检测出目标蛋白以及检测得出的结果有没有准确性产生决定性作用。
灵敏度不够怎么办？
要是试剂盒的灵敏度不足, 那样你能够思索更换个检测原理。就像传统的双抗夹心法灵敏度受限, 能够尝试化学发光法或者荧光法的ELISA试剂盒, 其灵敏度会高出许多。当然, 价格也会贵上一些。
化学发光法ELISA试剂盒, 老张最近正在使用, 其检测下限达到了1 pg/mL, 相较于之前他所使用的传统试剂盒, 灵敏程度高了十倍。他表示, 倘若你的样本浓度很低, 又或者你需要检测的是稀有的细胞因子, 那么选择具备高灵敏度的试剂盒会省去许多麻烦事。
总结一下老张踩过的坑
讲到这儿, 老张的事儿基本讲完了。他本是个做了六年实验的熟手, 却因ELISA检测试剂盒出了岔子, 而后一步步去排查问题、优化流程, 最终把项目给做成了。他讲, 这次经历让他对ELISA这个“小物件”有了全新认识。
他最后跟我讲了这么一番话, ELISA检测试剂盒并非买了便能够使用的, 你务必要先弄明白自身需求, 以及样本的类型, 还有试剂盒的特性, 方可着手去做。而前期的准备工作做得越是充分, 后期面临的麻烦也就越少。
假如你同样有着正在使用ELISA试剂盒的情状 , 那么不妨去对照一番上面所讲述到的这一系列问题 , 查看一下是否存在属于自我当前正深陷其中的那种失误地带。在进行实验的这条具体路径之上 , 每少踏入一个失误地带 , 势必将多余节省下一份时间。
