兔原代的细胞, 是从兔子的组织里直接分离而获得的细胞 , 保留了体内原本具备的生物学特性 , 在生命科学的研究方面应用得非常广泛。和传代细胞系相比较 , 原代的细胞更能够反映体内真实的状态 , 不过培养的难度也相比更高。掌握基本方面的操作要领 , 是实验成功的第一步。

兔原代细胞分离的关键步骤

第一步是获取兔原代细胞的分离, 这还是最容易出差错的所在环节。通常对组织来源进行选择, 选的是肝脏、肾脏或者肺脏, 取材之际要留意无菌操作, 以此来防止细菌造成污染。剪碎组织之处, 剪刀得锋利, 动作需迅速, 力求最大程度减掉对细胞存在的机械损伤。

细胞产量受消化酶选择的直接影响, 常用的是胶原酶与胰蛋白酶, 不同组织对于酶的敏感度存在差异, 例如肝脏组织运用胶原酶IV型效果更佳, 而肾脏组织或许需要将胶原酶与分散酶联合使用, 消化时间被控制在30分钟至2小时的范围之内, 温度维持在37℃, 每隔10分钟进行一次摇晃, 观察到组织块变得松散便可以终止。

滤和离心这两样环节, 同样是不可以马乎的, 先是采用那100微米并且70微米两种滤网按顺序去进行过滤, 进而去除掉并未消化处理过的组织碎片, 另外, 离心的这个速度建议设定在300至500g之间, 时间规定设定为5分钟时长才行, 否则要是速度过高的话, 就很容易对细胞膜造成损伤, 最后重悬的时候, 动作必须要做到轻柔, 防止产生气泡, 不然的话这将会对细胞贴壁造成影响呐。

兔原代细胞培养的常见问题

新手最头疼的问题是细胞不贴壁, 兔原代细胞贴壁能力弱, 培养皿得提前用多聚赖氨酸或者胶原蛋白包被, 接种密度也得留意, 密度太低细胞没法建立连接, 密度太高又容易老化, 一般建议每平方厘米2 - 4万个细胞, 24小时往后观察贴壁情况。

培养基的挑选也是颇具要害特性的。兔相关的原代细胞针对营养成分的需求是比较高的的, 基础的培养基常规情况下常用的乃是DMEM或者RPMI 1640, 是一定得添加10%到20%的胎牛血清的。血清的质量会直接对细胞的状态产生影响的, 建议挑选同一批次的血清, 以此来避免因批次差异所引发的影响。与此同时要添加1%的双抗以及谷氨酰胺,用以防范细菌的污染。

原代细胞存在细胞老化速度快这一通病, 兔原代细胞通常传代3至5代后便开始衰老, 其表现为细胞体积变大, 细胞增殖速度变慢, 细胞形态变得不规则, 建议在P1至P3代内完成实验, 若发现细胞状态下降, 要及时冻存早期代次细胞备用, 冻存液采用90%血清加10%DMSO, 经梯度降温后转入液氮保存。