ELISA试剂盒的最低检测限（Limit of Detection，LOD）是指能够可靠地检测到的被测物的最低浓度或量。它是一个重要的性能指标，用于衡量试剂盒的灵敏度。

确定ELISA试剂盒的最低检测限是一个系统性的过程，以下是确定ELISA试剂盒最低检测限的关键步骤和考虑因素：

1. 标准品的制备与稀释

使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，制备不同浓度的标准品溶液。这些标准品溶液将用于构建标准曲线。

能够被检测到的最低浓度的标准品即为初步的最低检测限[。

2. 标准曲线的构建

将不同浓度的标准品溶液加入到ELISA试剂盒中，按照说明书进行操作，最后读取吸光度值（OD值）。

利用这些数据构建标准曲线，横坐标为标准品浓度，纵坐标为OD值。通过回归分析得到标准曲线的方程。

3、灵敏度与检测范围

高灵敏度试剂盒（如Thermo Fisher化学发光法）可达fg/mL级，而常规比色法为pg/mL级‌。

线性范围需覆盖LOD至最高标准品浓度（如0.12-80 pg/mL）。

4、‌精密度要求

板内变异系数（CV）应<10%，板间CV<15%

批间一致性需通过质控品验证（如NIBSC标准品校准）‌。

5、‌干扰实验

需验证样本基质（如血清、脑脊液）对检测的影响，回收率应达80%-110%。

6、数据处理

通过绘制标准品浓度与吸光度值的关系图，建立标准曲线。一般采用四参数非线性回归模型来拟合数据点，确保曲线的准确性和线性范围。

7、计算LoD

LoD通常定义为能够以95%的置信水平检测到的最低浓度，即在空白对照孔的吸光度值加上3倍空白对照的标准偏差的吸光度值所对应的浓度。

8、考虑空白值和阴性对照

在计算最低检测限时，需要考虑空白值（即只加了稀释液的对照）和阴性对照的影响。如果空白值非常低，可以忽略不计；但如果空白值较高，则需要将其纳入计算中，以消除背景干扰。

★操作注意事项

1、样本稀释需避免钩状效应（高浓度样本需梯度稀释验证）‌。

2、试剂平衡至室温后再使用，防止水化层影响检测精度。‌

通过以上步骤，可以科学地确定ELISA试剂盒的最低检测限，确保实验结果的准确性和可靠性。‌