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甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒(比色法)
AS6321151
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产品详情

甲基柠檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)试剂盒说明书

                                         微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:                           

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理:

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体30mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入1mL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  • 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  • 将匀浆600g,4℃离心5min。
  • 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
  • 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS(此步可选做)。
  • 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)在试剂五中加入1mL无水乙醇和22mL试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六,混匀,记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。

MCS活性计算:

  1. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=177.8×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.3556×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

  1. 使用96孔板测定的计算公式如下:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=355.6×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.711×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

 

配方

试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存;(50mM Tris-HCl 7.4,8.56g 蔗糖,88mg EDTA)

试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存;(10mM Tris-HCl 7.4,1%Trixton-100)

试剂三:液体1.5mL×1支,4℃保存;(100mM PMSF)

试剂四:液体×1瓶,4℃保存;(称0.135g Tris,0.166g KCl,8.4mgEDTA,溶于27.5mL双蒸水,用HCl调pH至7.5)

试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存;(称取2mg DTNB,2mg 丙二酰CoA于30mL试剂瓶)

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;(称取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管)

 

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