您好,欢迎来到上海抚生实业有限公司!
400-990-7709 / 021-52961052(工作日9:00-18:00)
顺乌头酸酶(ACO)测试盒(比色法)
AS6321153
货号 纯度 规格 目录价 会员价 库存 数量 购买
AS6321153-100管/96样 100管/96样 ¥1000.00 登录查看
AS6321153-50管/50样 50管/50样 ¥550.00 登录查看
产品详情

顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒说明书

                                          微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上,生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:液体5mL×1瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加1.5mL蒸馏水充分溶解;现配现用

试剂七:粉剂×1支,4°保存;临用前加12mL试剂四充分溶解;

工作液:临用前在12mL试剂七中加入1mL蒸馏水、1mL试剂四、1mL试剂五、1mL试剂六充分混匀

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  2. 将匀浆转入离心管内600g,4℃离心5min。
  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性
  5. 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。

测定步骤

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
  2. 样本测定

(1)将工作液,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min;现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL样本160μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

ACO活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=268×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=54×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.108×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.216×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

 

相关产品
顺乌头酸酶(ACO)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321153 规格:100管/96样
羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321152 规格:100管/96样
甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321151 规格:100管/96样
乳酸含量(LA)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321149 规格:100管/48样
线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321148 规格:100管/96样
线粒体柠檬酸(MCA)含量测试盒(比色法)
产品编号:AS6321147 规格:100管/96样
乙酰辅酶A测试盒(比色法)
产品编号:AS6321146 规格:100管/96样
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321144 规格:100管/96样
丙酮酸脱氢酶(PDH)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321143 规格:100管/96样
琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321142 规格:100管/96样
柠檬酸(CA)含量测试盒(比色法)
产品编号:AS6321141 规格:100管/96样
α酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)测试盒(比色法)
产品编号:AS6321140 规格:100管/96样