亚铁氧化酶（Hephaestin,HP）试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Hephaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶，HP属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介导铁的跨膜转运中有重要作用。
测定原理：
HP催化Fe2+氧化为Fe3+，Fe2+和ferrozine反应显色，在560 nm下有特征吸光值。通过测定Fe2+的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。
自备用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体60 mL×1瓶，4℃保存;
试剂二：液体1.5 mL×1瓶，4℃保存;
试剂三：液体11 mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
按照组织质量（g）：水（mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
2. 在96孔板中加入下列试剂
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试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
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试剂一 |
50 |
50 |
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试剂二 |
10 |
10 |
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样本 |
10 |
10 |
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蒸馏水 |
30 |
30 |
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试剂三 |
混匀，40℃静置30 min |
100 |
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试剂三 |
100 |
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混匀，立即测定A对照和A测定，ΔA=A对照-A测定。(每个测定管需设一个对照管) |
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HP活性计算:
标准曲线：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x为标准品浓度，μmol/mL；y为吸光值ΔA)
单位定义：每g样本每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V总÷T ÷(W× V样÷V样总)× 1000
= 40.58×（△A+0.0006）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg蛋白每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V总÷T ÷（Cpr×V样）
= 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr
V总：反应体系体积，0.1 mL；V样：加入样本体积0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000，μmol到nmol的转换系数。
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资料/datasheet
