【检测原理】
本试剂盒根据荧光 PCR 技术原理,针对 PCR试剂盒设计特异性引物和 Taqman 探针,通过荧光 PCR 检测仪进行检测,从而实现对 PCR试剂盒的检 测。
【储存条件及有效期】
1.避光-20℃储存,有效期 12 个月。
2.低温运输不能超过 4 天;开封后避光-20℃储存,对有效期没有影响。避免反复冻融,冻融 6 次不影响检测效果。
3.生产日期、有效期至:见外包装盒。
【适用仪器】
适用于 ABI 7500、Bio-Rad CFX96、Roche480 等全自动荧光PCR 检测仪。
【样本要求】
1.样本种类:鼻/咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液;培养物等样品。
2.保存条件:采集的标本应及时送检,24 小时内检测的应 4℃保存,超过 24 小时的最好-70℃保存,并避免反复冻融。
【检测方法】
1 . 试剂准备(试剂准备区)
将试剂盒各组分置 4℃避光融化,充分混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数 N(N=样本数+1 管阳性对照+1 管阴性对照),根据下表配置反应体系mix,加入一适当体积离心管中,充分混匀后瞬间离心,按 20μL 分装至 PCR 反应管/板,并转移至样本处理区。
组分
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体积(μL )
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qPCR 预混液(含酶)
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16
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引物探针
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4
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总体积(反应体系 mix )
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20
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2 . 样本处理(样本处理区)
① 核酸提取
选择合适的核酸提取试剂盒提取核酸,具体按照相应的试剂盒说明书操作。
② 加样
在已加入反应体系 mix 的 PCR 反应管/板上分别加入处理好的待检标本核酸、阴性对照、阳性对照各 5μL,终体积为 25μL。
盖紧管盖或封膜,瞬间低速离心后置荧光 PCR 检测仪扩增。
3 . 扩增检测(核酸扩增区)
步骤
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温度
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时间
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循环数
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①预变性
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95℃
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5min
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1cycle
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②变性
退火/延伸/检测荧光*
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95℃
55℃
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10s
40s
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40cycles
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*步骤②中 55℃时荧光检测,检测通道为 FAM。*ABI 系列荧光 PCR 仪不选 ROX 校正,淬灭基团选 None。
4 . 结果分析根据分析后图像调节起止值,(建议起始设在 3~15、终止设在 5~20,同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击分析,在报告界面查看结果。
【质量控制】
1.阴性对照:Ct 值>38 或未检出。
2.阳性对照:扩增曲线呈 S 型,且 Ct 值≤30。
3.同一实验以上要求需同时满足,否则本次实验视为无效。
4.每种检测靶标都需设阴阳对照,不同的靶标根据对应阴性调整基线阈值。
【结果判读】
1.FAM 通道检测 B 组链球菌。
2.阴性:Ct 值>38 或未检出。
3.阳性:扩增曲线呈 S 型,且 Ct 值≤35。
4.可疑:扩增曲线呈 S 型,且 35<Ct 值≤38,需复检;复检结果若一致,判定结果为阳性。
【检验方法的局限性】
1.样品采集、运输、保存不当,试剂运输、保存、配置不当都可能会影响实验结果,甚至会导致假阴性结果。
2.如果实验室污染、试剂污染、样品交叉污染,可能出现假阳性结果。
【注意事项】
1.PCR 操作各阶段应严格分区操作,避免交叉污染。
2.试剂盒各组分使用前应充分融化混匀,离心数秒后使用。
3.各组分不得与其他产品或不同批号的相应成分进行互换。
4.待测标本若不及时检测,应保存于-20℃或-70℃。
5.样品的处理应该严格按照生物安全规范操作。
6.PCR 操作人员应具有经验和受过专业培训。
7.本试剂盒仅用于科研使用,不做为临床诊断使用。