可见分光光度法 50 管/48 样>
注
意：正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定
产品简介：
β-甘露聚糖酶（
EC 3.2.1.78）广泛存在于动植物和微生物中。用于饲料工业，不仅可
以消除饲料中的抗营养因子甘露聚糖，提高饲料利用率，还能促进有益菌的增殖，提高动物
免疫功能。
β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖产生寡糖和单糖，还原性寡糖和单糖在沸水浴中与3,5-二硝
基水杨酸（DNS试剂）反应显色反应，该显色物质在540nm下有最大吸收峰，通过测定还
原性糖的生成量进而计算得出β-甘露聚糖酶的酶活性大小。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器、
研钵、乙醇、冰和蒸馏水。
试剂盒组分与配制：
提取液：液体 60mL ×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 15mL ×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂 ×2 瓶，4℃保存；临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶加 5mL 试剂一，
可超声至溶解，溶解后 4℃保存。
试剂三：液体 10mL ×2 瓶，4℃保存；
β-甘露聚糖酶活性测定：
一、样本制备：
1、 组织：
1. 称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴匀浆，
4℃放置 10min；离心 5min（12,000rpm 4℃）；弃上清，留沉淀，
2. 向沉淀中加入经预冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；离心 5min（12,000rpm 4℃）；
弃上清，留沉淀。
3. 再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；离心 10min
（12,000rpm 4℃）；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。
2、 细菌/培养细胞：
1. 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；
2. 取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％
或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
3. 离心 10min（12,000rpm 4℃），取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（10
4 个）：提取液体积（mL）为 500：1
的比例进行提取。
3、 液体样本：
a) 若是澄清液体，直接检测；
b) 若液体样本浑浊，需离心 10min（12,000rpm 4℃），取上清液检测。
2、上机检测：
1、 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 所有试剂解冻至室温（25℃），
3、 在 EP 管中依次加入：
【注】若ΔA 差值低于 0.01，可增加样本取样质量 W 或延长孵育时间 T(如增至 60min)或
增加样本加样体积 V1（如增至 120μL，则试剂二相应减少），则改变后的 W 和 T 和 V1
需代入计算公式重新计算。 结果计算：
1、标准曲线方程为 y = 8.2857x - 0.0325；x 为标准品质量（mg），y 为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克组织蛋白每小时催化底物产生 1μmol 还原糖定义为一个酶活力单位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
3
]÷(Cpr×V1)÷T =16.8×(ΔA+0.0325) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：每克组织每小时催化底物产生 1μmol 还原糖定义为一个酶活力单位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
3
]÷(W×V1÷V)÷T =16.8×(ΔA+0.0325)÷W
4、按细菌/细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每小时催化底物产生 1nmol 还原糖定为一个酶活力单位。
β-甘露聚糖酶活力(nmol/h/10
4cell)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
6
]÷(500×V1÷V)÷T =16.8×(ΔA+0.0325)
5、按液体体积计算：
单位定义：每毫升液体每小时催化底物产生 1nmol 还原糖定义为一个酶活力单位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/mL)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
6
]÷V1÷T =16.8×(ΔA+0.0325)
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---加入样本体积，0.08mL；
T---反应时间，30 min=0.5 小时；
W---样本质量，g；
500---细菌或细胞总数，万；
Mr---180.55，标准品为甘露糖；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒；
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预实验的意义： 比色法检测试剂盒预实验非常重要 1、确定该试剂盒是否适合客户的样本检测，以免造成试剂盒和样本的浪费（比如低表达 处理的样本）； 2、熟悉生化试剂盒的操作流程，尤其是初次使用生化试剂盒测定； 3、确定样本的处理方法及稀释倍数是否合适； 4、了解实验过程中可能出现的实验现象或问题，以便于及时作出调整； 5、通过 3 - 5 组预实验，判断试剂盒对于样本的最佳适应稀释浓度范围，指导实验样本 稀释比例。 |
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资料/datasheet
