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乙醇酸氧化酶测试盒(比色法)

试剂别名:
CAS NO.:
分 子 式:
分 子 量:

乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)试剂盒说明书

                                                微量法 100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.1)是植物光呼吸代谢中的关键酶,也是光下合成草酸的关键酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。

测定原理

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加5mL双蒸水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:液体2mL×1支,4℃保存。

酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g, 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定操作表

 

测定管

样本(μL)

10

试剂一(μL)

130

试剂二(μL)

40

试剂三(μL)

20

充分混匀,立即于微量石英比色皿/96孔板中测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2,△A=A2- A1

酶活性计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 392×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性(nmol/min /g 鲜重)= ×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 392×△A÷W

ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 784×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义每克组织每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性(nmol/min /g 鲜重)= ×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 784×△A÷W

ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,0.5cm;V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min

 

 

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