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多聚半乳糖醛酸酶(PG)测试盒(比色法)

试剂别名:
CAS NO.:
分 子 式:
分 子 量:

多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase,PG)试剂盒说明书

微量法100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是一种细胞壁结合蛋白,可以催化果胶分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,参与果胶的降解,使细胞壁结构解体,导致果实软化,与果实成熟、叶和花的脱落、病原物防御,细胞伸展发育以及木质化有关,在植物抗病性和食品贮藏保鲜领域具有较高的研究价值。

测定原理

多聚半乳糖醛酸酶水解果胶酸生成半乳糖醛酸,具有还原性醛基,与DNS试剂反应生成红棕色物质,在540nm有特征吸收峰,测定540nm处吸光值变化可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体8mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体15mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提取

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。16000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后16000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。

3.培养液:直接检测。

测定操作表

 

对照管

测定管

样本(μL)

 

30

煮沸样本(μL)

30

 

试剂一(μL)

 

120

蒸馏水

120

 

40℃水浴30min

试剂二(μL)

150

150

沸水浴5min,冰浴或自来水冷却,取200μL于微量石英比色皿/96孔板测定540nm处吸光值A,△A=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

酶活性计算公式

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×Cpr)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性(mg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3.按液体体积计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按细胞数量计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量    

V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h

  

  1. 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×Cpr)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。

PG活性(mg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3.按液体体积计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。

PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)

4. 按细胞数量计算

酶活性定义在40℃,pH6.0条件下,每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。

PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量

V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h

注意事项

煮沸样本建议将样本在沸水中煮沸10分钟,以将酶彻底灭活。

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